实验一 质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测.doc

实验一 质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测一、 实验内容1. 采用碱裂解法提取质粒DNA2. 采用限制性内切酶对质粒进行酶切3. 采用琼脂糖电泳对所提取的质粒DNA及其酶切产物进行鉴定二、 实验目的和要求1. 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法2. 掌握限制性内切酶酶切DNA的操作过程3. 掌握琼脂糖电泳的原理和方法三、 实验仪器、材料和试剂 1.仪器：摇床、无菌操作台、离心机、电泳仪、凝胶成像仪等 2. 材料：移液枪、枪头、离心管、三角烧瓶等 3. 试剂：LB培养基，卡那霉素，质粒提取试剂盒，琼脂糖，电泳缓冲液TAE,核酸染料，DNA Marker(DL2000，-Hind III digest DNA Marker), EcoR I内切酶等。四、实验操作1. 质粒提取（1）挑取单菌落至3 mL LB液体培养基，37摇动（200 rpm）培养过夜。（2）转移菌液至1.5 mL Eppendorf管中，12000 rpm离心45 sec，尽量弃尽上清。（3）加入250 ml 预冷的PI(请先检查是否加入RNaseA)，使用移液器彻底混匀细菌沉淀，充分悬浮，静置2 min。注意：如果有未彻底悬浮的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度的偏低。（4）向离心管中加入250ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈振荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒收到破坏。如果未变得清亮，可能菌体过多，裂解得不彻底，应减少菌体量。（5）向离心管中加入350ul 溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心1min，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小的白色沉淀，可再次离心后取上清。（6） 向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附管重新放入收集管中。（请用当天处理过的柱子）（7）将步骤（5）获得的上清液用移液管转移到吸附柱CP3中（将吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。（8）向吸附柱CP3中加入500ul去蛋白液PD，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。（9）向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇）12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。（10）重复操作步骤（9）（11）将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）。为了确保下游试验不受残留乙醇的影响，建议打开吸附柱CP3的盖子，置于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（12） 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100ul洗脱液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中（12）利用分光光度计对提取的pGEX-4-T质粒DNA进行定量测定。（13）取3 L 提取的质粒DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测。（14）-20保存。2. 质粒酶切按以下酶切反应体系酶切质粒pET-28a：10H Buffer2 LddH2O7 LEcoR I1 LpET-28a10 L（1g）Total20 L酶切反应条件：37下酶切1 h，用1%琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果。3. 琼脂糖电泳（1）配制 1% 琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖, 置于试剂瓶中，加入30 mL 0.5 TAE工作液，将该试剂瓶置于微波炉加热直至琼脂溶解。（2）胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净，晾干，放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子，将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液倒入30mL 于小烧杯中，加入1.2L的核酸染料（Gold view），轻轻摇匀，小心地倒在有机玻璃内槽上，使胶液慢慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下放置30 min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上刚形成相互隔开的上样孔。待用时，将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电泳缓冲液TAE的电泳槽中备用。（3）加样：将样品4ul与上样液（6X）1ul混合后，用微量加样器将上述样品加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面，样品孔容量约为10 mL左右。（4）电泳：加完样后的凝胶板可以通电进行电泳。建议在80-100V的电压或20 mA下电泳。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1.5 cm时，停止电泳。（5） 染色、观察和拍照：在紫外灯下观察凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。采用凝胶成像系统拍摄电泳带谱，并作结果分析。五、结果分析如图所示，泳道顺序为大Marker、非酶切样品、酶切样品、非酶切样品、酶切样品、非酶切样品、酶切样品、非酶切样品、酶切样品、小Marker。本实验为单酶切反应，