近红外光谱法快速检测牛奶中氯霉素残留.docx

近红外光谱法快速检测牛奶中氯霉素残留氯霉素(CAP)是一种广谱抗生素，大剂量反复使用，会造成CAP 在牛奶及奶制品中的残留。氯霉素对胃、肠、肝脏等有一定的损害作用，还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎，因此各国对食品中氯霉素残留量都制定了严格的限制标准。目前我国采用的氯霉素药物残留的检测方法有微生物法、毛细管区域电泳法、高效液相色谱法、气相色谱- 质谱法、液相色谱- 质谱法等，但是上述分析方法都有如下缺点：一连串物理或化学操作会破坏样品；样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐。近红外光谱(NIR)分析技术是20 世纪70 年代后逐渐兴起的一种新型快速定量分析方法，它具有前处理简单、无污染、方便快捷、不破坏检材、可在线检测等优点。被普遍用于食品、药品和石油工业、环境科学，生物学和医学等领域。近红外光谱中有效信息率低，对复杂样品进行近红外光谱分析需从复杂、重叠、变动的光谱中提取微弱信息。本实验采用多元散射校正作为光谱数据的预处理方法结合偏最小二乘法(PLS)建立牛奶中氯霉素残留的定量分析校正模型，并用所建模型对预测集样品中的氯霉素含量进行预测，取得较好的效果。表明该方法在食品安全控制方面有很大的应用前景。1 材料与方法1.1 材料、试剂与仪器鲜奶；氯霉素标准品(纯度99.4%) ；MPA型傅立叶变换近红外光谱仪；LC-10ATvp高效液相色谱仪；SPD-10A紫外检测器； XYJ 80-2电动离心机1.2 算法原理1.2.1 偏最小二乘法偏最小二乘是一种广泛应用的多元统计数据分析方法，其在自变量空间和应变量空间分别寻找某些线性组合(潜变量)，并使得两个变量空间的协方差最大。与传统多元线性回归模型相比，偏最小二乘回归的特点是：能够在自变量存在严重多重相关性的条件下进行回归建模；允许在样本点个数少于变量个数的条件下进行回归建模；偏最小二乘回归在最终模型中将包含原有的所有自变量；偏最小二乘回归模型更易于辨识系统信息与噪声( 甚至一些非随机性的噪声) 。1.2.2 多元散射校正 (MSC)MSC 可以有效剔除样品颗粒度、填装密度、湿度等物理因素导致的散射影响，从而提高光谱的信噪比。它利用在样品光谱与理想光谱之间建立线性关系的方法消除散射带来的影响。1.3 训练集和预测集样品的制备和选取用双蒸水分别配制浓度10、30、50、70g/ml 氯霉素贮备液，将贮备液用牛奶稀释成0.1426g/ml 到4.8857g/ml 浓度范围内的 64 个样本，为了更加接近于实际分析样品，配制后的牛奶在4冰箱内放置72h。以高效液相色谱法测得的浓度作为理论含量。PLS 法要求校正集样品的含量必须涵盖预测集，因此64 个样品中，先选择1个最高和1个最低含量的样本, 然后随机选择34个样本作PLS 法的训练集, 其余28个样本作为预测集。1.4 光谱采集将样品分别装于1mm石英样品池中在125004000cm-1间扫描，分辨率为8cm-1。扫描次数为32 次。以InGaAs检测器检测光谱数据，每个样品重复扫描3 次，取平均值。由图1 可以看出，牛奶中成分在近红外谱区均有吸收，且水峰(71007500cm-1 以及50005500cm-1)干扰严重，氯霉素在牛奶中的限量较低，用经典光谱分析方法难以进行定量分析。1.5 高效液相色谱法1.5.1 色谱条件流动相：乙腈-5mmol/L 磷酸氢二铵溶液(20:80，V/V)；色谱柱：汉邦C18(150mm 4.6mm，5m)； 固相萃取小柱：AGT Cleaner tm C18 SPE (3ml/500mg)；波长：278nm；流速：1.0ml/min；柱温：常温。在上述色谱条件下，CAP 和内标的保留时间分别为17.99min 和16.39min，杂质和内源性物质无干扰，典型色谱图见图2 、3 .1.5.2 牛奶样品预处理方法在10g 牛奶样品中加入25g/ml 非那西丁溶液20l 作为内标(IS)。提取过程是在样品中加入5mol/L 盐酸溶液0.1ml ，再加入25ml 乙酸乙酯。经振荡、离心，取出上层提取液，用氮气吹干。残余物用20ml 4%NaCl溶液溶解，并用20ml 正己烷去除脂肪。将盐溶液加在已用5ml甲醇活化并用5ml水冲洗过的C18固相萃取小柱(3ml/500mg)上，2ml 40% 甲醇冲洗，2ml 甲醇洗脱，60氮气吹干。残余物用100l 流动相溶解。2 结果与分析2.1 光谱区域选择对模型准确性的影响近红外光谱区主要反映分子中含氢基团的倍频与合频, 光谱重叠严重，如采用全谱建模计算量巨大，而且与样品的组成或性质间缺乏相关关系。为了找到最有用的光谱区域，可以将测定的氯霉素含量数据与样品的光谱数据进行关联，找出相关系数较大的光谱区域。从表1 中可以看出，在6101.95446.2cm-1 光谱区域，内部交叉验证均方差(RMSECV=0.0816)较低，内部交叉验证决定系数(R2=99.63)较高，维数(4)比较合适，而且水峰在此波段的干扰较小( 水峰的位置为71007500cm-1 以及50005500cm-1)。说明此区域是光谱信息最丰富的区域，有用的主成分( 即维数) 基本包括在内，在此区域建立的模型准确性较高。2.2 光谱预处理方法对模型准确性的影响牛奶在非均质状态下的特殊性使其近红外光谱之间产生了明显的差异。样品的散射是引起这种差异的主导因素。样品的散射程度主要依赖于所选测量光的波长以及样品的颗粒大小和折射率等物理性质，因此散射对于整个光谱而言，在各个波长点处对光谱的影响是不同的。为了尽可能消除散射效应对光谱的影响，采用多元散射校正对光谱进行处理。从图4 可以看出经过多元散射校正后不同浓度的光谱相对于原始光谱差别明显增强。为了进一步验证多元散射校正法能有效提取光谱中的有用信息，消除背景和漂移对光谱的影响，分别采用矢量归一化、最小- 最大归一化、消除常数偏移量和多元散射校正作为光谱预处理方法，然后结合PLS 建立数学模型。由表2 可以看出，采用多元散射校正预处理方法相对于其他预处理方法优势明显。2.3 维数选择采用PLS 方法建立定量分析模型时，主因子数(又称主成分数) 的选择直接关系到模型的实际预测能力，使用主因子数过少，就不能充分反映样品的光谱信息；使用主因子数过多则会将一些噪音的信息也掺入计算，降低模型的预测能力。本研究考察主因子数对RMSECV值的影响，当RMSECV 最小时，所选主因子数最佳。牛奶中氯霉素残留的定量分析校正模型交互验证结果见图5 ，由图5 可以看出，其最适主因子数为4 。2.4 最佳模型的建立表3 预测集回收率采用多元散射校正对光谱进行预处理，选择波长范围在6101.95446.2cm-1 的光谱，主因子数为4，建立牛奶中氯霉素含量的最佳定量分析模型，校正集样品中氯霉素浓度的预测值与真实值间的R2 为99.63，RMSECV0.0816，RMSEP 为0.228。训练集平均回收率为99.54%，预测集回收率结果见表3，其平均回收率为99.77%，可以看出本研究建立的近红外光谱分析法可以有效测定牛奶中的氯霉素残留。平均回收率(%)=式中，Cip 为第i个样本的预测值，Ci为第i个样本的标准值，n 为样本数。3 结 论本研究采用多元散射校正结合PLS 法建立牛奶中氯霉素含量定量分析模型，该方法不需对样品进行化学处理，方便快捷。多元散射校正预处理方法可有效地消除牛奶在非均质状态下的特殊性以及样品内部成分颗粒大小的分布不均匀而造成的光谱差异，PLS 能较好的解析近红外漫反射光谱严重重叠现象，解决各组分干扰问题。由于各