骨关节炎滑膜中尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体蛋白的表达.pdf

骨关节炎滑膜中尿激酶型纤溶酶原激活物 及其受体蛋白的表达 王万春 王 跃 孙材江 中南大学湘雅二医院骨科 长沙 410011 摘要 目的 检测尿激酶型纤溶酶原激活物 uPA 及其受体蛋白 uPAR 在骨关节炎 OA 滑膜中的表达 探讨 uPA 系统在 OA 发病中的病理作用 方法 采用免疫组织化学方法检测 26 例OA 和 10例正常滑膜组织中uPA 和 uPAR 蛋白的表达水平 结果 26例 OA 滑膜组织中 uPA 阳性表达19例 73 uPAR 阳性表达14 例 54 6 10 例正常滑 膜组织中 uPA 阳性表达2 例 20 uPAR 阳性表达 1例 10 uPA 和uPAR 在 OA 滑膜中主要分布于滑膜衬里层细 胞 衬里下层单核细胞 巨噬样细胞及血管内皮细胞 OA 滑膜组织中 uPA 和 uPAR 蛋白的表达水平呈直线相关 r 0 920 P 0 01 结论 OA 滑膜组织中高水平的 uPA 和 uPAR 蛋白表达 提示在 OA 滑膜炎症和软骨降解等病理过 程中 uPA 系统起着重要作用 uPA 起协同作用 关键词 骨关节炎 尿激酶 免疫组织化学 中图分类号 R684 3 文献标识码 A 文章编号 1000 5625 2001 03 0257 04 Expression of urokinase type plasminogen activator and its receptor protein in synovial tissues from osteoarthritis WANG Wan chun WANG Yue SUN Chai jiang Department of Othopeadics The Second XiangyaHospital Central South University Changsha 410011 China Abstract Objective To study the expression of urokinase type plasminogen activator uPA and its re ceptor uPAR in the synovial tissures and the significance of uPA and uPAR in degradation of extracellular ma trices in osteoarthritis OA then analyse the possible relationship between uPA and uPAR Methods Im munohistochemical analysis technique was used to detect uPA and uPAR protein expression and distribution in synovial tissues in 26OA patients and 10 mormal individuals Results Positive staining of uPA and uPAR pro tein were detected in 19 cases in the 26 OA samples 73 while only 2 positive cases were seen in the 10 mormal tissues 20 The expression rate of uPA protein was markedly higher in OA than in the normal P 0 01 The expression of uPAR was seen in 14 cases in all 26 OA samples 54 6 while there was only one case in 10 normal samples 10 the positive rate was significantly higher in OA than in normal samples P 0 05 Positive expression of uPA and uPAR proteins were found in synovial lining cells mononuclear cells macrophage like cells and endothelial cells Using the correction analysis we found a positive correlation between uPA and uPAR reactivity in the synovial tissues in OA r 0 920 P 0 01 Conclusions The high expression of uPA and uPAR protein inOA synovial tissues indicate that the uPA system may play an impor tant role in the process of synovitis and degradation of OA cartilage extracellular matrices In the pathologic pro cess of OA uPA and uPAR coordinate each other lead to the genesis and development of OA cartilage degrada tion Key words osteoarthritis urokinase immunohistochemistry Bull Hunan Med Univ 2001 26 3 0257 04 骨关节炎 osteoarthritis OA 是一种常见的骨关 节疼痛性疾病 其特征是关节软骨进行性降解 丧 失 伴随着肥大性骨病变 如关节周边骨赘形成 软 骨下骨板增厚 骨关节炎的发病机制与增龄 肥胖 慢性损伤 遗传 免疫等因素有关 一般认为骨关节 炎是由于各种致病因素损伤了软骨细胞 释放出各 种蛋白酶 引起软骨基质中的蛋白聚糖与胶原纤维 网络的降解 使软骨结构破坏 水肿 弹性降低并引 起滑膜炎症 病变关节的滑膜和软骨还能分泌各种 细胞因子 激活蛋白裂解酶 导致进行性骨与软骨的 破坏 近年来对骨关节炎的研究重点转移到引起关 节软骨和骨基质降解的各种酶 以金属蛋白酶和丝 257 湖南医科大学学报 BULL HUNAN MED UNIV 2001 26 3 收稿日期 2000 08 16 作者简介 王万春 1962 男 湖南长沙人 医学博士 副教授 从事创伤骨科与关节外科研究 氨酸蛋白酶研究较多 目前 国内对 uPA 系统与 OA 的关系研究甚少 也未见 uPA 和 uPAR 的相关性研 究报道 为此 本研究运用免疫组织化学的方法检 测OA 患者滑膜中 uPA 和 uPAR 的表达水平 旨在进 一步探讨 uPA 在 OA 发病中的作用及 uPA 和 uPAR 之间的相关性 1 对象与方法 1 1 对象 为 2000 年 9 月 2001 年 4 月在本院行 关节清理术或人工关节置换的 26 例OA 患者 其中 男7 例 女 19 例 年龄 44 68 56 12 6 岁 病史 3 19 平均 8 4 年 手术前 3 周内均未服用非甾体类 抗炎药及激素 所有患者均经临床及关节镜或直视 下确诊 均符合 1991年 Altman 1 诊断标准 10 例胫 骨平台骨折行开放手术或半月板损伤行膝关节镜检 术的患者作为对照组 其中男 7 例 女 3 例 年龄 26 64 45 17 6 岁 两组患者于关节镜检术中以咬 钳咬取关节滑膜 3 5 片 每片为 3 mm 3 mm 2 mm 如行开放手术则直接切取滑膜 约 10 mm 10 mm 3mm 1 2 试剂和仪器 1 一抗为鼠抗人即用型 uPAR 单克隆抗体 购自福州迈新公司 及兔抗人即用型 uPA 单克隆抗体 购自武汉博士德公司 均为美国 Oncogene Science 公司产品 HIGH SABC 免疫组化 染色试剂盒和 DAB 显色剂 购自武汉博士德公司 2 主要仪器石蜡切片机 820 型 Histo STAT 美国 恒温干燥箱 101 5 型 上海 显微镜 CK2 型 Olympus 日本 关节镜 M5501 型 Wolf 德国 1 3 方法 所有组织标本一经取下后立即用 10 福尔马林固定 常规石蜡包埋 4 m 连续切片 分别 行HE 染色和 uPA uPAR 蛋白HIGH SABC 法免疫 组化染色 结果判断 结合 HE 染色切片 根据苏 木素复染后的细胞形态 鉴别滑膜组织中的不同细 胞类型 在 10 40倍光学显微镜下观察组织切片 的显色反应 用已知阳性片作阳性对照 PBS 代替一 抗作阴性对照 凡细胞质和 或细胞膜上出现明显 的棕色或棕黄色颗粒为 uPA 或 uPAR 蛋白阳性细 胞 参照 Szekanecz 2 等方法 根据 10 40 倍高倍 镜视野下滑膜组织中的阳性细胞占全部细胞 包括 滑膜衬里细胞 滑膜下层单核细胞 巨噬细胞样细胞 及血管内皮细胞 的比例判断 阴性 为无阳性细 胞或阳性细胞数 70 对每个标本取 5 个不同 视野计数 取其平均值 1 4 统计学处理 运用 SPSS 统计软件 采用 x 2 检 验及相关分析 2 结 果 2 1 骨关节炎滑膜 HE 染色 OA 患者滑膜衬里层 细胞增厚 部分区域滑膜衬里层细胞达 4 7 层 滑 膜细胞肥大 以巨噬细胞样细胞增多为主 有少量淋 巴细胞浸润 滑膜下层毛细血管轻度增生 中度炎性 浸润 广泛纤维化 2 2 uPA 在关节滑膜中的表达 uPA 蛋白阳性反应 定位于细胞质 呈黄色或棕黄色颗粒 26 例OA 中 uPA 蛋白阳性 19 例 阳性表达率为 73 1 其中阳 性 2 例 7 7 阳性 8 例 30 8 阳性 9 例 34 6 阴性 7 例 26 9 10 例正常滑膜中 uPA 蛋白阳性 2 例 20 阴性 8 例 80 两组比较差异有显著性意义 P 0 01 uPA 蛋白阳性细胞主要分布在滑膜衬里层 和滑膜下层 呈阳性染色的主要是滑膜衬里细胞 滑膜下层单核细胞和血管内皮细胞 附图1 附图 1 uPA 蛋白阳性细胞分布于滑膜衬里层细胞 单核细胞和血管内皮细胞 2 uPAR 蛋白阳性细胞分布于滑膜细胞和单核细胞 ABC 法 400 Fig 1 Positive staining of synovial lining cells mononuclear cells and vasular endothelial cells 2 Positive staining of synovial cells and mononuelear cells ABC 法 400 2 3 uPAR 在关节滑膜中的表达 uPAR 蛋白阳性 反应主要定位于细胞质 少部分定位于细胞膜上 呈 黄色或棕黄色颗粒 26 例 OA 中 uPAR 蛋白阳性 14 例 阳性表达率为 53 8 其中 阳性 2 例 7 7 阳性 12 例 46 2 阴性 12 例 46 2 10 例正常滑膜中 只有 1 例uPAR蛋白弱 258湖南医科大学学报 2001 26 3 阳性表达 10 两组比较差异有显著性 P 0 05 阳性信号主要定位于滑膜细胞和单核细胞 附 图2 2 4 OA 患者关节滑膜中 uPA 和 uPAR 表达的相关 性分析 26 例 OA 患者的 uPA 和 uPAR 阳性的细胞 百分比两者呈高度正相关 r 0 920 P 0 01 3 讨 论 尿激酶型纤溶酶原激活物 urokinase type plas minogen activator uPA 是一种丝氨酸蛋白酶 具有高 度特异性激活纤溶酶原为纤溶酶的活性 在体内多 种细胞能合成 uPA uPA 合成后以无活性的单链前 体 pro uPA 的形式释放 pro uPA 的活性仅为 uPA 的几百分之一 在细胞由蛋白裂解酶 如组织蛋 白酶 B 3 纤溶酶 裂解为双链有活性的 uPA 活化 的 uPA 主要作用于细胞迁移和组织修复 介导细胞 周围基质蛋白的降解 除了可以激活纤溶酶原外 uPA 自身还能直接降解细胞外基质和基底膜 4 值 得注意的是纤溶酶本身又可直接裂解 pro uPA 为 uPA 从而形成一个正反馈环 尿激酶型纤溶酶原激活物受体 urokinase type plasminogen activator receptors uPAR 是 uPA 的细胞 受体 分子量为 55 60 103的糖蛋白 含有 313 个氨基酸残基 由三条相似的富含半胱氨酸的区域 重复构建而成 uPAR 通过糖基磷脂酰肌醇链 GPI 附着在细胞膜表面 能特异性地结合 uPA 和大分子 pro uPA 使聚集在细胞表面 与受体结合的 uPA 催化细胞表面的纤溶酶原形成纤溶酶 产生蛋白溶 解连锁反应 导致细胞膜和细胞外基质的破坏溶解 pro uPA 和 uPA 通过它们氨基末端的生长区域与 uPA 结合后 极大地增强了纤溶酶原的活化 从而加 速了细胞外基质蛋白降解 细胞浸润等病理过程 uPAR 可以与细胞粘附分子和细胞外基质成分结合 如细胞表面的整合素 1 3 玻璃体结合蛋白和整合 素 5 诱导白细胞粘附和趋化 进一步导致细胞侵 袭 uPA 和 uPAR 在炎症过程中时白细胞趋化 白细 胞 内皮细胞相互作用以及血管形成中发挥着重要 作用 uPA 在类风性关 节炎 Rheumatoid arthritis RA 和OA 等炎症性关节病的滑膜 软骨 滑液甚至 血浆 中的表达均 增高 但以 RA 病人中增 高明 显 6 7 OA 滑膜 软骨中 uPAR 的表达也增高 8 OA 滑膜成纤维细胞 软骨细胞 单核 巨噬细胞多 型核白细胞以及内皮细胞均能合成表达 uPA 和 uP AR 9 uPA 在炎性关节病中通过两条途径来产生其 病理作用 其一为纤溶酶依赖性途径 被 uPA 活化的 纤溶酶 除直接引起软骨和骨基质蛋白降解外 还具 有多种功能 如纤维降解 前金属蛋白酶活化 潜在 的细胞因子活化 导致关节软骨和骨基质的进行性 降解 其二为非纤溶酶依赖性途径 是指分泌的 pro uPA 和 uPA 结合 uPAR 后可以直接促进炎性细胞 的有丝分裂 迁移和粘附 也可以直接引起细胞外基 质降解 从而引起关节炎症性病变 10 uPA 纤溶酶系统与细胞因子之间的相互联系和 相互作用 也间接地促进 OA 的病变 白细胞介素 1 IL 1 肿瘤坏死因子 TNF 转化生长因子 TGF 粒细胞 单核细胞集落刺激因子 GMCSF 都可以增强 uPA 的合成和分泌 TNF 干扰素 TFN 和 bTGF 则可诱导单核细胞表面 uPA 的表 达 11 本研究从蛋白水平检测了 OA 及正常滑膜组 织中uPA 和 uPAR 的表达水平 定位和分布 结果 显示 滑膜衬里层细胞 滑膜下层单核细胞巨噬细胞 样细胞 多型核白细胞以及内皮细胞均出现 uPA 和 uPAR 的表达 正常滑膜组织中虽也有表达 但其强 度明显低于 OA 滑膜 滑膜中增高的 uPA 除引起或 加剧滑膜炎症外 还可直接释放入关节液中 激活软 骨中的纤溶酶原 滑膜中被激活的纤溶酶也可释放 入关节液中 引起关节软骨基质的降解 OA 滑膜衬 里层细胞 uPA 增高并与各种细胞因子间相互作用 使得滑膜炎症迁延 软骨细胞外基质降解 导致关 节软骨的进行性破坏 Walter 12 和 Pap 13 分别发现 uPA 在 OA 关节软骨破坏严重的表浅层强烈表达 并 且uPA 的水平与关节软骨破坏的严重程度密切相 关 他们认为 活检 OA 关节软骨 用免疫组化方法 检测 uPA 可作为一种评估 OA 的病变情况指标 进 一步支持了 uPA 系统在 OA 基质降解中的重要作 用 此外 Kikuchi 14 等人发现在细胞外基质降解的 病理过程中 MMP3 和uPA 有相互协同作用 uPA 可以通过多种途径来调节滑膜炎症和软骨 破坏 uPA 可以直接引起炎症细胞分化增殖 迁移 和粘附 10 uPAR 则被认为是单核细胞的激活抗 原 它与巨噬细胞分化 细胞外蛋白水解 粘附细胞 外基质 ECM 刺激基质金属蛋白酶 MMP 的产生 有关 5 uPA 和 uPAR 与其它炎性介质在关节滑膜 上相互作用 共同促进其表达 uPA 本身可以增加 单核细胞上 uPAR 的数量 导致滑膜局部炎症的持 续存在和蛋白裂解 本研究发现 OA 滑膜组织中 uPA 和 uPAR 蛋白的表达 两者呈直线相关 具有良 好的协同性 在 uPA 表达强的病例 uPAR 的表达也 增强 这进一步证明了 uPA 和 uPAR 在炎症部位具 有相互促进作用 在 uPA 介导的纤维降解过程中 uPA 和 uPAR 的协同高表达可促使滑膜细胞等具有 免疫活性的细胞具有更高的增生活性和更大侵袭破 坏力 以适应其蛋白溶解活动的需要 关于 uPA 及 其抑制物在 OA 患者软骨中的表达 在血浆和关节 液中的含量以及 uPA 与金属蛋白酶协同作用引起关 节软骨破坏的具体机制等有待于进一步研究 259骨关节炎滑膜中尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体蛋白的表达 王万春 等 参考文献 1 Altman RD Criteria for classification of clinical osteoarthritis J J Rheumatol 1991 18 10 12 2 Szekaneca Z Haines GK Koch AE Differential expression of the urokinase receptor CD87 in arthritic and normal synovial tissues J J Clin Pathol 1997 50 314 319 3 Ikeda Y Ikata T Mishiro T Cathepsins B and L in synovial fluids from patientswith rheumatoid and the effect of cathepsin B on the acti vation of pro urokinase J J Med Invest 2000 47 61 75 4 Murphy G Atlinson S Ward A et al The role of plasminogen acti vators in the regulation of connective tissue metalloproteinase J Ann NY Acad Sci 1992 667 1 12 5 Nakano S Ikata T Kinoshita I Characteristics of the protease activity in synovial fluid from patientswith rheumatoid arthritis and osteoarthritis J Clin Exp Rheumatol 1999 17 161 170 6 Cevinic MM Generini S Partsch G et al Synoviocytes from os teoarthritis and rheumatoid arthritis produce plasminogen activators and plasminogen activator inhibitorl and display uPA receptors on their sur face J Life Sci 1998 63 441 453 7 Ronday HK Smits HH VanMuijen GH et al Difference in expres sion of the plasminogen activation system in synovial tissue of patient with rheumatoid arthritis and osteoarthritis J BR J Rheumatol 1996 35 416 423 8 Jalkanen S Leukocyte endothelial cell interaction and the control of leukocyte migration into inflamed synovium J Springer Semin Im munopathol 1998 11 187 198 9 Kikuchi H Shinmada W Nonaka T et al Significance of serine proteinase and matrix metalloproteinase systems in the destruction of human articular artilage J Clin Exp Pharmacol Physiol 1996 23 885 889 10 Waltz DA Chapman HA Reversible cellular adhesion to vitronectin linked to urokinade receptor occupancy J J Biol Chem 1994 269 14746 14750 11 Kirchheimer JC Nong YH RemoldHG IFN gamma tumor necro sis factor alpha and urokinase regulate the exprssion of urokinace receptors on human monocytes J J Immunol 1998 141 4229 4234 12 Walter H Kawashima A Nebelung W Immunohistochemical analysis of several proteolytic enzymes as parameters of cartilage degradation J Pathol Res Pract 1998 194 73 81 13 Pap G Eberhardt R Rocken C Expression of stromelysin and uroki nase type plasminogen activator protein in resection specimens and biopsies at different stages of osteoarthritis of the knee J Pathol Res Pract 2000 196 219 226 14 Kikuchi H Shimada W Nonaka T Significance of serine proteinase and matrix metalloproteinase systems in the destruction of human artic ular cartilage J Clin Exp Pharmacol Physiol 1996 23 885 889 本文编辑 陈扬宝 上接第 250 页 参考文献 1 Rifas L Fausto A Scott MJ et al Expression of metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human osteoblast like cells differentiation is associated with repression of metalloproteinase biosynthesis J Endocrinology 1994 134 213 221 2 Kusano K Miyaura C Inada M et al Regulation of matrix metallo proteinases MMP 2 3 9 and 13 by interleukin 1 and interleukin 6 in mouse calvaria association of MMP inductionwith bone resorption J