生物技术大实验完整版.doc

生命的基本特征：细胞是生物的基本组成单位（病毒除外） 新陈代谢、生长和运动是生命的基本功能 生命通过繁殖而延续，DNA是生物遗传的基本物质 生物对外界可产生应激反应和自我调节，对环境具有适应性生物学经历的三个阶段：描述 生物学阶段、实验、创造生物技术：也称生物工程，是以现代化生命科学为基础，运用先进科学原理和工程技术手段按预先的设计来加工或改造生物材料，从而产生出人类需要的产品或达到某种目的生物技术发展三个阶段：作坊式 生物技术、工业化、现代生物技术内容：基因 工程技术、细胞、酶、发酵、蛋白质细胞工程：指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术蛋白质工程：是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。蛋白质工程也成为“第二代基因工程”生物技术基本特征：高效益 高智力 高投入 高竞争 高风险 高势能透光度t：某一波长的光透过某一物质的溶液时，其入射的角度I0与透过溶液后的强度I相比发生了变化：I与I0的比值（I /I 0)称为透光度实验室常用水的制备：利息交换法 蒸馏法 反浸法 超纯法消毒灭菌方法：高压高温灭菌 干热灭菌 滤膜灭菌 化学消毒法 紫外线灭菌 抗生素灭菌消毒核酸的一级结构：线性结构，核苷酸的排列顺序，也称碱基序列二级结构：双螺旋结构三级结构：超螺旋结构DNA的变形：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程增色效应：核酸变性后，在260nm处吸收值上升DNA的复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象减色效应：DNA复性时，OD260值下降影响复性速度的因素：溶液温度的高低 单链片段的大小 单链片段浓度 溶液离子强度的大小 片段内重复序列的多少OD260的应用： OD260=1.0 相当于 50ug/ml 双链DNA 40ug/ml 单链DNA或RNA20 ug/ml 寡核苷酸基因（分子生物学概念）：基因是DNA双螺旋分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列管家基因：某些基因是维持细胞基本代谢所必须的基因，其在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达阅读框架：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码子为止的一个连续编码序列基因的结构：外显子、内含子、前导区、尾部区、调控区三个关键因素：自由复制的DNA序列 着丝粒DNA序列 端粒DNA序列 原核生物和真核生物染色体的区别： 原核生物的染色体实质上是一个裸露的DNA双螺旋结构，DNA通常呈环状，且与相对少量的蛋白质结合，长度可打达几厘米，DNA复制从单一复制起点开始 真核生物都有许多线状的染色体，且染色体存在于细胞核内，真核生物染色体由DNA、组蛋白、RNA、非组蛋白等成分组成。这些蛋白具有功能或结构方面的作用。染色体DNA的数量远比原核生物多。每条染色体有多个复制起点分离纯化核酸的总原则：保证核酸的一级结构完整性 防止核酸的生物降解 排除其他分子的污染真核细胞DNA制备实验基本原理：要从组织中提取DNA就必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎包膜及核膜，使染色体释放出来，同时还要除去与DNA结合的组蛋白及非组蛋白质粒按复制方式分：松弛型质粒、严密性质粒质粒特性：分子相对小 含高效的自主复制成分 不相容性 转移性 选择的标记 限制性内切酶单一切口碱裂解法原理：在PH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭合环质粒DNA人为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS作用下形成沉淀，儿质粒DNA 仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。质粒尚在上清中，在用酚氯法抽提进一步纯化质粒DNA电泳：是指带电粒子在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。影响电泳迁移率的因素：1，样品：即颗粒所带净电荷的数量、大小及形状。2，支持介质：惰性材料有一定坚韧度，吸附力小，无电渗作用。吸附作用：是介质对样品颗粒的吸附作用，所以出现拖尾和条带不均匀，纸最大，醋酸纤维素介质最小，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶居中。电渗：在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动为电渗。其产生原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基因，因此吸附溶液中的正离子和负离子，使溶液分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现不同的迁移率，这就是分子筛效应。影响凝胶电泳的因素：1DNA分子的大小 2琼脂糖的浓度 3DNA分子的构象 4 电源电压 5嵌入燃料的存在 6离子强度的影响聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点：1、在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。 2、化学性能稳定，与初分离物不起化学反应在很多溶剂中不溶。 3、对PH和温度变化较稳定。 4、几乎无吸附和电渗作用。5、样品不易扩散，用量少。其灵敏度可达10-66、凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。 7、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中集浓缩，分筛和电荷效应为一体。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理：当向蛋白质溶液中加入足量SDS，可引起构象改变，蛋白质SDS形成的复合物近似“雪茄烟“形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于分子量大小，所以它们以相等的迁移率速度从浓缩胶进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而别分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤：1、胶膜固定2、制备分离胶3、制备浓缩胶4、准备电泳5、上样6、电泳7、染色8、脱色9、观察结果第六章限制性核酸内切酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。细菌限制性内切酶的修饰机理：各种细菌都可以合成一种或几种切割顺序专一的DNA内切酶，这种酶的主要功能是对外源性的双链DNA进行切割、水解不允许外源性DNA存在细菌自身细胞内，而自身的DNA可以不受酶的切割因为细菌细胞还合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核苷酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解，这就是限制性内切酶修饰系统。限制性内切酶分类：型、型、型型特点：限制性内切酶修饰系统是由两种酶分子组成的，一种为限制性内切酶另一种为独立的早基化酶，其修饰作用是与限制性内切酶识别位点相重叠的序列。识别特定的核苷酸序列3、具有特定的酶切位点酶活性单位：在一定温度，PH及离子强度条件下，1小时内完全酶解（切割）特定底物DNA，所需要限制性内切酶的量，为该酶的活性单位。酶的标准反应体系：在50ML反应体系中及指定温度下，使用特定的缓冲体系，用一个活性单位的限制性内切酶酶解1pg底物DNA反应1小时，为该酶的标准反应体系。星号活性：限制性内切酶在非标准反应条件下，某些限制酶的识别或切割位点发生改变，不再严格遵循识别位点酶解DNA的活性称星号活性。基因克隆：通过体外重组技术将一段目的DNA经切割，连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程基因重组可分为三个水平：整体水平，细胞水平和分子水平一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：获得待克隆的DNA片段（基因） 目的基因与载体在体外连接 重组DNA分子导入宿主细胞 筛选、鉴定阳性重组子 重组子的扩增与表达载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫做载体作为基因克隆的载体必须具备以下特征： 载体必须是复制子 具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选 具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入 自身分子量较小，拷贝数高 在宿主细胞内稳定性高载体的种类按其功能分类：克隆载体、表达载体、整合载体载体根据外源性DNA进入载体的方式特点分为：插入型载体、替代型载体常用的载体可以分为三大类：质粒、噬菌体及病毒质粒生物学的特性：质粒是染色体外能够进行自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子，它并不是细菌生长所必须的，但可以赋予某些细菌抵御外界环境因素不利影响的能力质粒的大小差异很大，最小的只有1kb，只等编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb 质粒生存在寄主细胞中“友好”的“借居”，离开了寄主它本身无法复制，同时质粒往往有宿主专一性 质粒的复制类型，一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为严紧型质粒（大）。细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞中只有1-2个质粒 质粒的不亲和性，两种亲缘关系密切的不同不能在同一宿主细胞内质粒不相容性：同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定的保持在一个细胞内的现象质粒相容性：若两种质粒进入同一细胞时能够一起复制并共存于该宿主细胞内称为质粒相容性 质粒的转移性 转移性质粒：含有接合转移基因，能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞 非转移性质粒：不含有接合转移基因，质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种噬菌体感染机理：在感染早期以以环状分子进行转录之后有两种生活途径，一种是溶菌周期：烈性噬菌体又叫溶菌循环，即环状DNA的多次复制，合成大量基因产物，组成噬菌体颗粒，宿主菌裂解后，流向下一个循环感染烈性噬菌体溶菌生长的基本过程 吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来DNA重组：DNA分子的体外重组是指在体外的条件下采用一定的技术将任何感兴趣的DNA片段连接在一起的过程适当的宿主细胞必须符合以下条件： 对载体的复制和扩增没有严格的限制 不存在特异的内切酶体系降解外源DNA 在重组DNA增殖过程中不会被修饰 重组缺陷型DNA不会产生体内重组 容易导入重组DNA分子 符合重组DNA操作的安全标准重组克隆的筛选方法：抗药性标志的筛选 蓝白斑筛选法 菌落快速裂解鉴定法 内切酶图谱鉴定法 通过聚合酶链式反应筛选重组子 噬菌斑形成能力筛选法平台期效应：反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而是进入线性增长期或静止期，即出现“停止效应”。反应体系：4中dntp混合物，引物，模板DNA，TagDNA聚合酶，Mg2+。引物设计原则：1.序列要位于高度保守区。2.引物长度以1530bp为宜。3.碱基尽可能随机分布。4.引物内部避免形成二级结构，严重影响DNA聚合酶的延伸。5.引物3端不可修饰，引物5端可以修饰。原位PCR技术：其基本方位为1.固体组织或细胞，将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻璃片上，并用多聚甲醛处理，除去细胞内源性过氧化物酶.2.蛋白酶k消化处理用60ug/ml.3. PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液覆盖并加液体石蜡，直接放在扩增仪金属片上进行PCR循环扩增。4.杂交：用标记寡核苷酸探针进行原位杂交。5.显微镜观察结果。标记PCR技术：利用同位素或荧光素对PCR引物5端进行标记。反向PCR技术：用反向引物来扩增两引物以外的未知片段，在已知序列处设计引物。不对称PCE：不对称PCR是用不等量的一对引物，扩增后产生大量的单链。多重PCR：两对以上的引物，多种病原体检测或鉴定。PCR基本原理：类似于DNA的天然复制过程，以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下按照半保留复制沿着模板延伸，直至完成新的DNA合成。探针：是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子，并可以被特殊的方法所探知。核酸分子探针：则是指特定的已知核酸片段能与互补核酸序列退火杂交用于待测核酸样品中特定基因序列的探测。探针的两个条件：1.应是单链，若为双链，必须先进行变性处理。2.应带有容易被检测的标记。探针的种类：根据分子来源 一、基因组DNA探针，长度在几百碱基对以上。DNA探针，优点：1.来源充足。2.来源充足。3.标记方法较成熟，有多种方法可供选择。二、CDNA探针：不含内含子及其他高度重复序列，因此事一种较为理想的核酸探针。三、RNA探针：单链分子它与靶序列的杂交反应效率很高1.在更严格条件下进行杂交特异性更高。2.不存在互补双链的竞争结合。四、寡核苷酸探针：制备原则1.长度一般为3050个bp，过长者杂交时间较长，合成量低，过短者特异性差。2.碱基中（G+C）的含量应在40%60%超出此范围会增加非特异性杂交。3.探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的发夹结构。优点：1.制备简单，寡核苷酸探针以核苷酸为原料，通过合成仪短时间内合成，方法简便。2.序列任定。3.易穿透组织，由于链不长，而且是单链。4.杂交时间短。5.使用简便。一个理想的探针标记物应具备以下几种特征：1.高度灵敏性。2.标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响其碱基配针。3.应不影响探针分子的主要理化特性，特别是杂交特异性和杂交稳定性，杂交体解链温度无较大改变。4.酶促反应进行标记，应对酶促活性无较大的影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性。5.检测方法还应具有高度特异性。6.应具有较高的化学稳定性，保存时间较长，标记及检测方法简单。7.对环境无污染对人体无损伤，价格低廉等。异常血红蛋白病：由于基因突变导致血红蛋白肽链中氨基酸异常而形成的异常血红蛋白而引起的疾病。基因诊断：所谓基因诊断，就是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断，是一种新的临场诊断方法。1. 真核细胞DNA制备实验步骤：如果材料为组织块：可将组织块剪碎后，置入液氮中，随后用冰冷的组织捣碎。每100mg组织加入1.2ml消化液（100mmol/L NaCl 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 0.25mmol/L EDTA 0.5%SDS 0.1mg/ml 消化酶） 缓冲液：10mM Tris-HCl (ph 7.4) 150mM NaCl 110mM EDTA 0.5% SDS 如果材料是悬浮细胞，收集细胞于微量离心管中，500g x 5min 离心，若是贴壁细胞，弃上清后，胰消化收集细胞。500 x 5min离心，随后用冰冷的PBS洗涤细胞。500g x 5min 离心，弃上清，重复一次。并用一定体积的消化液重悬细胞组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中，50消化12-18h冷却至4，加等体积饱和酚轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀4 5000 rpm8000rpm 离心 15min20min，此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白层用习惯小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管，注意尽量不要带