生理学实验--斑马鱼视动反应讲义.doc

斑马鱼视动眼动反应实验目的： 观察视觉行为学的表现掌握评判视觉功能的行为学手段 实验原理：行为学虽是一门古老的学科，但至今仍是神经生理研究中不可或缺(indispensable)的一个活跃领域。经典行为学实验一般不依赖或很少需要精密的测量仪器，而是靠我们去观察和思考。眼动(optokinetic response, OKR)和视动(optomotor response, OMR)反应均是视觉刺激诱发的运动行为。脊椎动物从低等的鱼、蛙到高等的灵长类和人都有此行为反应。此现象无需学习训练就易诱导、较稳定、易观察，所以作为一种客观指标广泛运用于视觉功能的检测和评价。脊椎动物为了获得对运动图像刺激在视网膜上稳定清晰的成像，通过视觉通路和相应的运动神经参与做出生理性行为的适应调整从而能够对视觉刺激做出良好反应，这些表现涉及视动、眼动或视动性头震颤(Optokinetic head nystagmus, OKHN)。如果行为学的表现不正常，可以推测它们的固有神经连接出现异常。斑马鱼具有脊椎动物类似的视觉通路，经典的视觉行为学有眼动反应和视动反应。眼动(光动)反应：斑马鱼在光适应一段时间后会对移动的光栅进行注视，试图确保移动视觉图像能稳定地高分辨地呈现在视网膜上。如果光栅是在一个围绕幼鱼的圆筒上移动时(图1)，斑马鱼的眼睛就会一直追随光栅直到其眼睛不能再转动，然后有一个急速的眼颤动(ocular nystagmus)以回复到最初水平。之后又进行下一个追随反应，如此循环。周围视觉环境周期性运动时引起的有规律的眼或头追踪运动(慢相运动)即为眼动反应或视动性头震颤。五天龄(5dpf) 的幼鱼视觉系统就已非常成熟(viewed in Bilotta, 2001)，适合行为学检测。该行为学指标常用于筛选与视功能相关的不同遗传背景或操作的幼鱼。视动反应：视动反应是指斑马鱼对移动的目标有一种追逐的行为。当将成年斑马鱼放在一个圆形光栅的内部时，斑马鱼对光栅的追随行为会表现为一种圆周性运动(图2)。图1 眼动反应装置 图2 成鱼视动反应装置 转速显示 照明开关 电机开关 正反转开关 转速旋钮 通风开关实验设备：试剂：30 mm Petri dish，6% methylcellulose（Sigma），Embryo media，Rearing water (见附表)，海绵，橡皮泥，动脉夹，大头针，7-9dpf幼鱼，成鱼，计时器，烧杯 仪器：OKR apparatus (图3), 体式镜，视频摄录设备，微波炉，搅拌加热台实验步骤Part 1: 成鱼OKR3.0cm3.0cm2cm3cmFig.4 1. 自制海绵块（如图4）; 2. 将海棉块放在玻璃杯的底部，倒入少部分的水，挤出海绵中的气泡; 3. 插入第一根针，位置大概在海绵的中间; 4. 麻醉成鱼，用动脉夹夹住尾巴; 5. 将鱼背部朝上放在海绵上，一侧的胸鳍放在大头针的前面; 6. 插入第二根针，位置在对侧胸鳍的后面，类似于第一根针; 7. 在鱼缸的壁上靠近鱼尾的位置蘸上一块橡皮泥，将动脉夹按在橡皮泥 上; 8. 在生殖孔的两侧分别插入第3、4根大头针; 9. 在第1、2与第3、4之间分别插入第5、6根大头针; 10. 腮部两侧分别插上第7、8根大头针; 11. 为了防止鱼体上浮，第9、10根针在背鳍前部附近斜插跨过鱼的身体; 12. 倒入养鱼水，水深6cm左右; 13. 让斑马鱼苏醒10min; 14. 打开光源，光强度适应1min; 15. 打开电动机，光栅刺激适应1min; 16. 记录眼动反应。注意事项:a. 大头针的目的只是为了固定住斑马鱼，因此只要能达到这个目的，大头针没有必要太紧以影响到鱼的正常呼吸和生理功能;b. 用以小片纱布裹住鱼的尾巴，然后再用动脉夹夹住可以减少尾巴断裂的可能性;c. 腮部旁边的两个大头针不能阻挡它对光栅的视野。 Part 2: 幼鱼OKRA. 甲基纤维素幼鱼的固定是用甲基纤维素来进行的，一般常用的是6%的，配制如下：1. 将140ml ddH2O放进微波炉中高档加热3min;2. 在玻璃烧杯中加入60ml的ddH2O，并放入冰箱中冰冻;3. 将沸腾的热水转移到热台上并搅拌;4. 称取12g methylcellulose，缓慢的倒进沸水当中，当甲基纤维素在表面逐渐成块的时候可以用玻璃棒在水面轻微搅动以促进其溶解;5. 继续搅拌3 min直到methylcellulose充分分散开来, 加入35滴 NaOH (1mol/L)并继续搅拌35min;6. 将上述容易转移进一个塑料的烧杯中，然后加入60 ml 的冰块迅速冷却;7. 当溶液因快速冷却而变得透明的时候将其放进冰箱，静置2h后可用。注意: a. 为了防止剧烈的冷却对玻璃烧杯的损伤，可以将热的溶液转移进塑料烧杯中进行;b. 当冰块加入之后溶液变得透明，还应继续在冰箱中保持2h以上，否则不会形成粘稠样液体。B. 幼鱼准备 1. 前一天下午五点将一雌二雄配对在繁殖缸中，第二天早上抽板并在1h后收集鱼卵;2. 鱼卵用embryo medium在 28.5 孵育，光照/黑暗周期为14:10h;3. 鱼卵按正常饲养方法进行，本实验选取的是5dpf的幼鱼。C. 实验步骤1. 在55-mm petri dish中加入20ml 6%的methycellulose，防止有气泡产生; 2. 放进几条幼鱼在培养皿中，将它们摆成一排; 3. 将装置放在体式镜下面并打开光源;4. 在鱼的尾巴部位添加一个小气泡，这个小气泡有助于反射周围的光栅运动;5. 转动光栅并记录他们的眼动反应。Part3: 成鱼 OMR成鱼的OMR也可以在此装置中进行，不同的是在fish chamber中心放置一个圆柱以阻止斑马鱼在运动过程中从中心穿过。1.捞一条成鱼在fish chamber中并加入6cm高的养鱼水;2. 将一个直径2cm的圆柱立在fish chamber的中央;3. 光强度与光刺激适应各1min;4. 打开摄像机并记录相关的行为。思考题：1、 如果斑马鱼幼鱼不用甲基纤维素而用养鱼水会怎样?那为何用甲基纤维素较理想?2、 在OKR中，除了眼睛的运动还会有什么部位会有运动，为什么？3、 猜想视神经损伤后对于眼动或是视动反应具有什么影响？注意事项：1. 妥善保管数码相机,以防摔落;2. 当心玻璃器皿,尤其是仪器上匹配的玻璃装置;3. 切记防止水泼入仪器;4. 操作体视镜获取视频时动作轻柔;5. 实验后,归还斑马鱼于指定容器.参考文献：邹苏琪，殷梧，胡兵 斑马鱼行为学实验在神经科学中的应用 生物化学与生物物理进展，2009，36(1): 512附表:1L Embryo medium:10.0 ml Hanks Stock #11.0 ml Hanks Stock #210.0 ml Hanks Stock #4959.0 ml dd H2O10.0 ml Hanks Stock #510.0 ml fresh Hanks Stock #6Use about 10 drops 1 M NaOH to Ph 7.2 Stock #1 8.0 g NaCl 0.4 g KCl, in 100 ml dd H2O Stock #2 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous 0.60 g KH2PO4, in 100 ml dd H2O Stock #4 0.72 g CaCl2, in 50 ml H2O Stock #5 1.23 g MgSO4-7H2O, in 50ml dd H2O Stock #6(fresh)0.35 g NaHCO3, in 10 ml dd H2ORearing waterIn general, adults can be maintained in tap water，If there is any question about water quality， use deionized or distilled water