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Western Blot试验宝典Western Blot试验宝典Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎一配胶这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.70.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在分子克隆上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度10%时可用0.1%的SDS封，浓度10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴10%的AP最好现配现用，如在4存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉过硫酸铵（APS）(10%;w/v)取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。此溶液4下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气二样品处理先制备蛋白样品，后灌注压缩胶，压缩胶灌注后应在2040min内使用。上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer（别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题： 1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂） 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80中保存，但要注意不要反复冻融。 三电泳所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1loading buffer上样，Marker也用1loading buffer调整至与样品等体积低电压短时间的预电泳（恒压10-20V,20-30min），清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，四转膜由于转膜过程中的气泡问题对于实验结果有很大的影响切记：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许气泡存在。将PVDF膜先在甲醇中浸泡几分钟,再转移到转膜缓冲液中处理15min。PVDF膜，125200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡，才能用如果WB前没有可参考的资料比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件（稀释度），可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂；切个小角是常用的方法。膜上要做好标记，识别正反面和上下膜彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的半干电转移要防止过热转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好切记。封闭时间和封闭剂的量都要足够。封闭不完全，后面就全白忙活了五封闭及杂交可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的WB稀释度附近做23个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST或 TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。一抗溶液中加入0.2% 叠氮钠后可4存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试六发光鉴定一般的WB检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase）最熟悉的底物应该是33二氨基联苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。DAB的选择有一点小小的技巧33二氨基联苯胺4盐酸盐的纯品分子量为360.1，通常是深棕色粉末，不太好溶于水，容易得到有色颗粒的溶液而导致膜上的背景，而且价格还被炒得贵；但是如果选择2水合33二氨基联苯胺4盐酸盐（分子量396.14）就是白色粉末状晶体，易溶，溶液无色均匀，量大价格还便宜。HRP化学发光反应底物，化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光，不同于生色反应般形成不溶的产物于膜上累积，所以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检测。分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lEDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。所以选择正确的蛋白Marker也是Wb实验成功的必要条件之一。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。多次反复冻融对于蛋白的危险，不用多说吧。这种预染蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率真的有这样一种产品，抽掉了WB中费时的非必需步骤转膜和封闭，直接在PAGE电泳胶上做免疫印迹！这个几乎颠覆传统WesternBlot概念的技术创新，完美演绎了“没有做不到，只有想不到”这一句话。注意事项:1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关.因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次剃度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如,透析.2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度.因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合.3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内.4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的旗袍和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min)5. 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20存放数,但是反复冻融会使蛋白质降解8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印.9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系.11. 转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC膜对应正极 首页 相册 标签Westernblot的原理、操作及注意事项 2006-11-30 15:41:00 | By: chenfengabj 原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。一、抗原的选择和制备A：样品的制备1组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0研磨，加入5STOPbuffer，180W，6mins，0超声波破碎，5000rpm，5mins离心，取上清。加入-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20保存，用时取出，直接溶解上样。2细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5STOPbuffer，收集，180W，6mins，0超声波破碎，5000rpm，5mins离心，取上清。加入-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20保存，用时取出，直接溶解上样。3分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入-ME、溴酚蓝制样。B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。2.Lowry法：此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。3.紫外吸收法：大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.10.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.52.5之间变化。所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10l/ml100l/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：光密度之差求得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。4.Bradford比色法：Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20µl），以0.15mmol/lNaCl补足至100µl，同时以两管100µl的0.15mmol/lNaCl作空白对照。每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100µg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100µg另作一标准曲线进行测定。5电泳估算法（我们选择此法）：样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。以提取癌组织总蛋白为例：取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗510次，再用预冷的1PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。每2克组织加入3ml1PBS匀浆，保持在4条件进行。加入5STOPBuffer缓冲液1ml，混匀，4下超声碎化。再加入0.5ml-ME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDSPAGE）A：实际操作1.做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的spacer、comb和架子。2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。2.制胶，电泳1）装好架子。2)按照下面配方配制分离胶。(单位：ml，Total：8ml)7.51015%2Sep.buffer44430Gel.sol2.02.74ddH2O1.91.20TEMED8ul8ul8ul10%APS80ul80ul80ul在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。(单位：ml，Total：3.5ml)32Stacking.buffer1.730Gel.sol0.35ddH2O1.4TEMED5ul10%APS50ul倒好后插入预先准备好的梳子。4)待胶凝集好后，上样，电泳。上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在1.5小时左右。B：注意事项及常遇到的问题1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2(载荷面即：如果你的胶槽是5mm1mm，则载荷面为：1mm5mm=5mm2)。3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。5）电泳中常出现的一些现象：条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。三、转移在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2umforMW20kDa)。A半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。1实验条件的选择电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度转移时间(h)80-1408%1.5-2.025-80101.515-40120.75=膜=胶。2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。5）转移时间一般为1.5小时，(1mA-2mA/cm2，10%gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。B湿法我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。C转移后效果的鉴定1染胶用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。2染膜有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-sred、FastgreenFC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。四、封闭（block）封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有bovineserumalbumin(BSA)，non-fatmilk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fatmilk。在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。Block4CO/N，或RT1小时。五、孵育一抗A.先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。B.配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释，最好采用梯度稀释。C.将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用RT1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。六、洗涤用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins*5。洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。七、孵育二抗孵育RT1小时。一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核素等）的。八、洗涤用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins*5。洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。九、显色（HRP酶）1增强化学发光法(ECL)Ecl显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。试验步骤：1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。5）显影、定影。6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。注意：荧光在一段时间后会越来越弱。2.DAB显色DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。对于AP标记的二抗我们选用BCIPandNBT显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。十、分析结果及其判断常见问题原因分析及处理方法：见附录一、二。附录一：TroubleshootingBlottingProblems（P4348）附录二：WesternBlottingTroubleshootingLogicTree（P390394）附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液1)5xStopSolution(Samplebuffer)pH6.7:Stock:touse:20%Glycerol100mltake9.5mlstock10%SDS50gor250ml20%SDSaddBME0.5ml250mMTris15.14gbromphenolblueortotal475.00mlpyronine4totaste2)Gelsolution(30%w/vacrylamidemix):0.8bis-acrylamide0.8g29.2%acrylamide29.2gtotal100ml3)2xLaemmliSeparationBuffer:0.75MTris-HCl90.825g0.2%SDS10ml20%SDStotal1000mlpH8.84)2xLaemmliStackingBuffer:0.25MTris15.14g0.2%SDS1gtotal500mlpH6.85)10xLaemmliRunningBuffer:250mMTris60.55g1.9MGlycine285.27g1%SDS20gtotal2literspH8.36)TransferBuffer:48mMTrisbase5.81g39mMGlycine2.93g0.037%SDS0.375g20%MeOH200mltotal1000ml7)TBST:10mMTris-HCl，1.21g100mMNaCl0.2%Tween-20Total1000mlpH7.48)CoomassieStain:40%MeOH400ml10%HAc100ml0.1%BBR1gBrilliantBlueRtotal1000ml9)Destain:30%MeOH300ml7.5%HAc75mltotal1000ml10)10丽春红染液配方：丽春红2g磺基水杨酸30g三氯醋酸30gtotal100ml11）DABDAB50mg0.05mol/LTB（PH7.6）100ml30%H2O230-40ul先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20避光保存，H2O2在工作液中终浓度0.01阅读全文 | 回复(1) | 引用通告 | 编辑 标签：Westernblot 上一篇：紫外吸收法测蛋白质含量 下一篇：NBA篮球手势Western Blot 原理和操作方法（全）Western Blot工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100g),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml)当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)5105 2-5分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10% 12% 15% 10% 12% 15%H2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.430%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.51.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 2.5 2.5 2.5 3.8 3.8 3.810%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.1510%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15TEMED(l) 4 4 4 6 6 6总体积(ml) 10 15浓缩胶试剂 浓度(5%)H2O(ml) 4 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.510%SDS(l) 80 4010%AP(l) 60 30TEMED(l) 8 4总体积(ml) 6 3蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80中保存，但要注意不要反复冻融。一：准备工作：一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器二：需要的溶液：裂解液 Laemmli样品缓冲液三：操作步骤：1)培养细胞蛋白质样品的制备：1：胰酶酶解后裂解：细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450l裂解液反复吹打。2：皿上直接裂解：细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450l裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后425000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合），强力混匀，样品置100水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。（样品可立即使用也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定保持数月）2)组织样品的制备：手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。）加入Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定保持数月。） 蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80中保存，但要注意不要反复冻融。一：准备工作：一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器二：需要的溶液：裂解液 Laemmli样品缓冲液三：操作步骤：1)培养细胞蛋白质样品的制备：1：胰酶酶解后裂解：细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450l裂解液反复吹打。2：皿上直接裂解：细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450l裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后425000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合），强力混匀，样品置100水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。（样品可立即使用也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定保持数月）2)组织样品的制备：手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。）加入Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定保持数月。）附：一：裂解液的制备：组织裂解液（全细胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.42: Nacl 150 mmoL/L3: 去氧胆酸钠 0.25%4：NP-40或Triton-x-100 1%5: EDTA 1 mmoL/L6： PMSF 1 mmoL/L7： Aprotinin 1g/ml8: leupeptin 1g/ml9: pepstain 1g/ml其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。细胞裂解液：1：NP-40裂解体系：150 mmoL/L Nacl1.0%NP-40或Triton-x-100 50 mmoL/L Tris(PH8.0)2：RIPA裂解体系：150 mmoL/L Nacl1.0%NP-40或Triton-x-1000.5%脱氧胆酸钠0.1%SDS50 mmoL/L Tris( ph8.0)二：Laemmli 样品缓冲液配置（1*SDS样品缓冲液）50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0）100 mmoL/L DTT2% SDS0.1% 溴酚蓝10% 甘油此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白浓度而定，40C长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中DTT应临时加入，以防降解。 蛋白质定量1)Bradford法:检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4至少6个月保持稳定.标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20g -150g/100l之间绘制标准曲线.将待测样本溶于100l缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS)按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去.每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟.根据标准曲线计算待测样品的浓度.2)Lowry法:检测原理: 是Cu2+与蛋白作用生成的Cu+与双缩脲试剂形成兰色络合物,菲林试剂增强兰色形成,750nm检测.首先,将20g碳酸钠溶于500ml水中;再将1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸钠溶于500ml蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存1年以上.Folin-ciocalteu酚试剂按体积比1:2:1将铜/酒石酸/碳酸钠,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室温下储藏,可稳定保存2周,标明为试剂A按体积比1:5将Folin-ciocalteu酚试剂和H2O混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存1个月,表明为时机B用蒸馏水将样本(5-100g)稀释为1ml,并准备100,50,25,12.5g /ml,4个浓度的BSA作为标准蛋白.每个蛋白样品家1.0ml试剂A,混合均匀,