8-实验室操作.doc

实验室操作 8实验室操作为预防有关危害的发生，我们在这一章节里讲述了一些实验室技术和方法的资料。预防措施是一个进行生物危害控制的重要元素，推荐实验室每一位工作人员认真仔细阅读这一章节。8.1与实验室事故相关的人为因素和态度以安全为目的，态度可以被定义为是知识和经验的积累物，它可以引导一个个体特定的操作。人为因素和态度可导致一种倾向，即部分个体对环境、人和物起到一个正面或负面的影响。实验室生物安全管理人员应明白自身的态度和人为因素对控制实验室生物安全影响的重要性。下面列出一些对管理人员有帮助的观测内容：在实验室事故中缺乏事故感知能力是一个重要因素。 以反常的速率工作是一个重要的引发因素。故意违反规章是引发事故的常见原因，期间存在很多危险因素。执行常规操作例如进行稀释和培养等是实验室事故发生时最常见的作业。 疲劳作业极有可能引发事故的发生。在有组织、宽敞的实验室里工作有助于防止事故的发生。每一位在存有生物危害环境里工作的人员必需时刻意识到为了预防实验室事故的发生，正确的态度是十分重要的。8.2 一级生物安全在实验期间实验室门保持关闭状态。按照操作规程使气溶胶的产生降到最小。在一级生物安全区域内不许吸烟、进食、喝饮料及贮存食物。穿实验服。 不许用嘴吸吸液管，应使用机械的吸液设备。 避免使用皮下注射针。 完成实验操作离开实验室前要洗手。 定期消毒工作台面，有液体飞溅应立即消毒。生物废弃物丢弃前需消毒。其它污染的原料在清洗、再利用或丢弃前也需消毒。污染物封口、耐用的、防漏的容器袋包裹，高压消毒后送到指定销毁点。控制昆虫和啮齿动物的出没。 保持工作区清洁。8.3 二级生物安全实验室门保持关闭状态。在使用或贮存有感染性物品的设备上贴上通用的生物危害标识。 只允许实验人员进入二级生物安全区域。二级生物安全区域内的试验动物不允许带出实验室外。在二级生物安全区域内不许抽烟、进食、喝饮料及穿戴首饰。必要时穿着个体保护装置（实验工作服，手套以及面部保护装置）；不能将保护装置穿到实验室外。卸下防护服离开实验室前要洗手。弄脏或污染了的防护服需更换。不许用嘴吸吸液管。应使用机械的吸液设备。按照操作规程使气溶胶的产生降到最小。 避免使用皮下注射针。尽可能使用塑料品替代玻璃品。使用生物安全柜容纳产生气溶胶的设备。完成实验操作离开实验室前要洗手。定期消毒工作台面，有液体飞溅应立即消毒。实验室内应有一生物学飞溅物处理工具。向生物安全负责人汇报与实验室获得性感染相关的飞溅物、事故、有关过错和疾病症状。所有容纳生物废弃物的容器上应贴有生物危害的标识。所有生物废弃物丢弃前需消毒。其它污染的原料在清洗、再利用或丢弃前也需消毒。污染物封口、耐用的、防漏的容器袋包裹，高压消毒后送到指定销毁点。控制昆虫和啮齿动物的出没。保持工作区清洁。8.4 生物危害物的运输（实验室间或物体间）需使用两层防漏容器，包括下列各项：密封的里层容器密封的外层容器在里层和外层容器间放入吸收剂（纸巾）适合于含有大量液体生物危害物的传送。外层容器上应贴有生物危害物名称。外层容器上应有实验室地址和电话号码。 尽可能使用塑料容器物，避免使用玻璃的。密封的塑料（非玻璃）原装小瓶可以用密封的、有标识的塑料袋进行传送。如果使用的内层容器必需是玻璃，传送时应放置在装有吸收剂的、密封的、坚韧的塑料容器内，用软垫填充。内层容器外表消毒后再放入外层容器内。外层容器消毒后才能送离实验室。8.5 基础生物安全操作实验室标本的收集、运输和处理不当，会带来使相关人员感染的危险。8.5.1标本容器标本容器可以是玻璃的，但最好使用塑料制品。标本容器应当坚固，正确地盖子或塞子盖好后应无泄漏。在容器外部不能有残留物。容器上应当正确的粘贴标签以便于识别。标本的要求或说明书不能够卷在容器外面，而是要分开放置，最好放置在防水的袋子里。8.5.2标本的收集、接受和标记需要接受大量标本的实验室应当安排专门的房间或空间并：1 始终遵循标准防护方法，所有操作均要戴手套。2 应当由受过培训的人员来采集病人或动物的血样。3 在静脉抽血时，应当使用一次性的安全真空采血管取代传统的针头和注射器，因为这样可以使血液直接采集到带塞的运输管和/或培养管中。用完后自动废弃针头。4 对每个标本作唯一性标识。5 装有标本的试管应置于适当容器中运至实验室，在实验室内部转运也应这样。检验申请单应当分开放置在防水袋或信封内。6 接受人员不应打开这些袋子。8.5.3标本在设施内的传递为了避免意外泄漏或溢出，应当使用盒子等二级容器，并将其固定在架子上使装有标本的容器保持直立。二级容器可以是金属或塑料制品，应该可以耐高压灭菌或耐受化学消毒剂的作用。密封口最好有一个垫圈，要定期清除污染。8.5.4打开标本及处理接受和打开标本的人员应当了解标本对身体健康的潜在危害，并接受过如何采用标准防护方法的培训，尤其是处理破碎或泄漏的容器时更应如此。标本的内层容器要在生物安全柜内打开，并准备好消毒剂。标本打开处理时：1 应当在生物安全柜内打开标本管。2 必须戴手套，并建议对眼睛和黏膜进行保护（护目镜或面罩）。3 打开标本管时，应用纸或纱布抓住塞子以防止喷溅。8.5.5避免感染性物质的注入1 通过认真练习和仔细操作，可以避免破损玻璃器皿的刺伤所引起的接种感染。应尽可能用塑料制品代替玻璃制品。2 锐器损伤（如通过皮下注射针头、巴斯德玻璃吸管以及破碎的玻璃）可能引起意外注入感染性物质。3 以下两点可以减少针刺损伤：（a）减少注射器和针头的使用（可用一些简单的工具来打开瓶塞，然后使用吸管取样而不用注射器和针头）；（b）在必须使用注射器和针头时，采取锐器安全装置。4 不要重新给用过的注射器针头戴护套。一次性物品应丢弃在防/耐穿透的带盖容器中。8.5.6血清的分离1 只有经过严格培训的人员才能进行这项工作。2 操作时应戴手套以及眼睛和黏膜的保护装置。3 规范的实验操作技术可以避免或尽量减少喷溅和气溶胶的产生。血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。严禁用口吸液。4 移液管使用后应完全浸入消毒液中。移液管应在消毒液中浸泡适当的时间，然后再丢弃或灭菌清洗后重复使用。5 带有血凝块的废弃标本管，在加盖后应放在适当的防漏容器内高压灭菌和/或焚烧。6 应备有适当的消毒剂来清洗喷溅和溢出标本。8.5.7对血液和其他体液、组织及排泄物的标准防护方法设计标准防护方法（其中包括“常规预防措施”）以降低从已知或未知感染源的微生物传播危险。8.5.8玻璃器皿和“锐器”1 尽可能用塑料制品代替玻璃制品。只能用实验室级别（硼硅酸盐）的玻璃，任何破碎或有裂痕的玻璃制品均应丢弃。2 不能将皮下注射针作为移液管使用。8.5.9用于显微镜观察的盖玻片和涂片用于显微镜观察的血液、唾液和粪便标本在固定和染色时，不必杀死涂片上的所有微生物和病毒。应当用镊子拿取这些东西，妥善储存，并经清除污染和/或高压灭菌后再丢弃。8.5.10自动化仪器为了避免液滴和气溶胶的扩散，可能的话这些仪器应采用封闭型的。1 排出物应当收集在封闭的容器内进一步高压灭菌和/或废弃。2 在每一步完成后应根据操作指南对仪器进行消毒。8.5.11清除污染建议使用次氯酸盐和高级别的消毒剂来清除污染。一般情况可使用新鲜配制的含有效氯1 g/L 的次氯酸盐溶液，处理溢出的血液时，有效氯浓度应达到5 g/L。戊二醛可以用于清除表面污染。8.5.12一次性接种环一次性接种环的优点是无需灭菌，因此可以在生物安全柜中使用。否则，使用明火会扰乱气流。一次性接种环使用后应置于消毒剂中，并按污染性废弃物处理。8.5.13微型加热器气体和电加热的微型加热器配有硼硅酸玻璃红火陶瓷保护罩，从而减少接种环灭菌时感染性物质的飞溅和散步。但微型加热器会扰乱气流，因此应置于生物安全柜中靠近工作面后缘的地方。8.5.14培养皿、试管和试剂瓶由于没有明确的事故发生及明显的溢出物，因此不能确定打开的平板、试管及试剂瓶里的一些微生物体是否会引起实验室感染。然而，这些很高的传染因子中很有可能有一些传染病会发生。当打开存在真菌类的平板、试管及瓶子时需格外小心，因为在操作中可能会释放出大量孢子。一些培养物应该在生物安全柜内进行操作。在吸取液体培养物前，为确保它成为均一的悬液，应给予振动混匀。剧烈的摇动将产生大量的气溶胶。轻微的打旋可以成为均一的悬液，但仍伴有微量的气溶胶产生。当液体培养物恢复原状停留片刻后再打开容器时，气溶胶产生减少。将消毒后热的金属接种环或针插入液体或斜面培养物会产生飞溅并产生气溶胶。为减少气溶胶的产生，金属接种环应在空气中冷却，或在容器内壁，或在繁殖物培养的琼脂表面没有物体生长的地方接触一下进行冷却。用特定设计的电或气体烧灼装置消毒的接种环或针，比用开口火焰加热的更可取。这种小型的烧灼装置有一个筒，可以包容从接种环或针上飞溅出的任何物质。通常可任意使用的接种环是有用的。加热使用过后为了能够立即消毒，丢弃首先放入消毒剂的容器中。在粗糙不平整的培养基上用接种环或针划线接种培养物会导致气溶胶的产生。如果培养基表面光滑整洁，通常是不会产生气溶胶的。丢弃粗糙不平整的培养基是好的安全技术。有盖培养皿内的培养物脱出的水里通常存在活的细小微生物，并且在倒转平板的盖子和边缘之间形成一层膜。当打开平板时这层膜破裂，释放出气溶胶。对于盖子与边缘只有三个接触点的塑料有盖培养皿可能减少危害物。使用完全干燥的平板也能减少这种风险，但是从厌氧罐内取出的孵育平板（进行厌氧孵育）很容易变湿。在盖子内装上过滤膜虽能减少危害物的产生，但不能防止扩散。如果平板明显潮湿，则应在生物安全柜内打开。打开有螺旋帽的瓶子和带塞的试管时会产生看不见的气溶胶。这是因为在打开塞子或盖时，感染性液体在塞子边缘处形成的那层膜被破坏，产生了气溶胶。振动或离心后立即取下长颈瓶、瓶子、离心管的棉花塞子或塞盖，产生气溶胶导致环境污染。长颈瓶或离心管不处于垂直状态，去除湿的瓶塞也会产生危害。此外，离心时会产生微量的泡沫，瓶塞很可能会被少许弄湿。由于这些可能性，因此应在生物安全柜内打开液体感染性培养物及危害物质，同时穿戴手套、长袖实验室工作服，这是很好的安全措施。干缩的、有感染性的培养物可聚集在盖子边缘或培养管/长颈瓶的壁上，当受到干扰时会扩散到空气里。装有干粉状危害物的容器应在生物安全柜内打开。8.5.15安瓿打开装有冻干或液体培养物的密封安瓿会产生气溶胶。为防止或减少气溶胶的产生，应在生物安全柜内打开安瓿。在复苏安瓿内容物时，要小心仔细以防割破手套和手，防止碎玻璃嘣入眼、脸及实验环境里。此外，生物产品本身不能因外界生物体或消毒剂而受到污染。应戴手套在生物安全柜内进行操作。用砂轮在安瓿的颈部划痕，消毒的湿酒精棉球包裹住安瓿，在安瓿的颈部用力折断，确保安瓿处于垂直状态。另一种方法，在安瓿的颈部做一标记，用热的金属环或棒接触使之产生裂缝，然后用消毒的湿酒精棉球包裹住安瓿，折断颈部打开。将棉球和安瓿顶端丢进消毒剂中。缓慢加入液体使安瓿内的内容物复苏，避免干燥浓缩状的内容物呈烟雾状扩散。混匀但无气泡产生，取出内容物放入干净容器内。一些实验人员想使用已有划痕的安瓿便于开口。但是，这样很可能使安瓿变得不坚固，在操作或贮存期间发生破裂。装有液体培养物的安瓿用同样的方法打开。为确保装有有害的、可流动的培养物及有活性的、粉状物质的玻璃器皿便于运输、孵育、贮存，应使用不易破碎的、防漏的外层容器应，体积足够的大以防玻璃容器渗漏或破损时可容纳所有的液体和粉末。外层容器必需贴上生物危害标识，包括感染性物质的名称。8.6 内务管理设计周全的内务管理程序和表格可降低从事与致病因子有关工作的风险度，并确保研究项目的完成。在进行操作的实验室内，内务管理的作用更加明确的体现出来。在有危害性操作的关键时刻，设计合理并能很好实施的内务管理程序可以限制注意力不集中这种身体上的影响因素，限制影响操作人员操作的因素；提供一个没有身体危害源及污染物的工作环境；提供一个对于突发事件中释放出来的致病因子可提高净化效率的工作环境。内务管理程序的制订最直接明显好处之一是对不同水平人员对污染物种类和污染源概念的培训。8.6.1 目的实验室内务管理的目的： 提供有序的工作环境利于科研项目的完成。使工作区域无自然危害物。为维持生物学系统的完整性，提供一个背景污染完全达到零水平的清洁工作环境，但实际上通过特殊措施的消毒方法达到这种水平是不必要的。 预防现在和过去实验中产生的可造成实验室人员危害的物质的聚积。使用内务管理程序预防危害物质气溶胶的产生。内务管理程序的改进应以人员和实验完整性可能遭受的最大水平危害为基础。通过人员的综合实践和再培训避免这种状况。日常内务管理程序可以预防组织废墟的聚集物：成为潜在微生物的窝藏处，对研究生物学系统的完整性有威胁。提高实验过程中不经意释放出的微生物的存活率。 阻碍净化污物的渗透力。通过衣服和鞋子从一个区域转移到另一个区域。 通过人员和空气的移动充分聚集后形成如同气溶胶物质一样的生物危害。 引起人员的过敏反应（例如：对动物的皮屑）8.6.2 适用范围在相当长的一段时间间隔后，为达到全部污物清除或主要的生物物质清除的效果，实验室实施内务管理。日常的内务管理是建立在提供一个无潜在污染源环境的基础上进行的。提供这样一个工作环境，用简洁的方法指示出应做的事情，谁去做以及进行的频率，并不是一件简单的事。监督员必须从有关的潜在生物危害方面严格检查每一项任务，制定出详细的程序，并对实验人员进行指导以减少误解的机会。下面略述了需实验室监督人严格监督的一部分条文。无需刻意按照这些条文去完成，这只是举一个例子，作为实验室内复杂的内务管理必须观察的详细方式介绍如下。 通道洗眼器 实验室进出路线 工作台上方地面 实验设备的清洁 生物安全柜玻璃器皿电冰箱 冷藏室 走廊贮藏室低温冰柜 培养箱 废弃物聚积 干冰柜 昆虫和啮齿动物的控制 工作台表面器具8.6.3 职责的分配实验室进行内务管理是安全完成研究项目的一种途径。将内务管理的任务分派给有经验的检查人员是十分重要的。被推荐的内务管理方法是对于直接的工作区域采取单独分管的原则，对于共同使用场所区域采取合作原则，将内务管理的任务分配给检查组。实验室生物安全管理员需监测单内务管理事务的完成次数。管理员应制定进度表和进行检查任务的频率并依此执行。当精密的实验仪器设备有特殊需求，应由专业的人员进行操作；应确定生物学准备的集中场所，以及使用处于准备状态或运作状态时有污染的器材的场所。8.7 菌（毒）种和生物样本管理8.7.1 生物样本采集应符合国家有关规定和技术标准的要求。样本采集人员应掌握相关专业知识和操作技能，并具有与采集病原微生物样本危害等级相适应的生物安全防护装备和防止扩散污染的措施。样本采集人员应对样本的来源、采集时间、采集人员等做好记