过氧化物酶活性的测定.docx

园艺学院 设施201402 李密实验三（一）过氧化物酶活性的测定（愈创木酚法）一、实验目的通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法和原理。二、实验原理以愈创木酚为底物，在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470 nm波长处有最大光吸收值，故可通过测470 nm波长下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。三、材料、设备和原理1. 材料 马铃薯块茎2. 设备 光光度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管3. 试剂 已配置好的反应混合液、20m mol/LKH2PO4、100m mol/L磷酸缓冲液四、 操作方法1.酶液制备 把马铃薯浆放于离心机中，在3000r/min下离心10min取1g去皮洗净的马铃薯块茎，入20mmol/LKH2PO4 溶液5ml于研钵中1.把马铃薯块茎研磨成浆上清液转入25ml容量瓶中定容 2比色测定把2只比色杯放入分光光度计中，调到470nm一只比色杯中加3ml反应混合液,KH2PO4溶液1ml,为参比液取2只半径为5cm比色杯每隔1min读数1次，连续测10min一只比色杯加反应混合液3ml，酶液1ml五、实验结果10分钟内测定的酶液吸光度时间（min）0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10A470 0.126 0.257 0.385 0.513 0.602 0.694 0.789 0.875 0.999 1.041 1.119计算： 酶活力（0.01A470/min）=A2-A1(t2-t1)0.01D =0.875-0.385(7-2)0.0125 =245.0酶的比活力（/g）=酶活力（）样品重g或样品中蛋白质的含量（mg） =245.00.9956=246.08六、讨论1、由于仪器较少,等待测POD值的时间较长,且没有放在低温下保持。导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。2、理论上POD值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系。可能原因有把酶液加入到3ml反应混合液时，反应太快，待到1min读取POD值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。离心出来的酶液在室温下放置时间过长。（二）可溶性蛋白质含量的测定（考马斯蓝G-250法）一、实验目的掌握测量可溶性蛋白的方法及其原理。二、实验原理可溶性蛋白质与考马斯蓝G-250反应生成青色产物，在595nm波长有最大吸收峰，其颜色深浅与可溶性蛋白含量成正相关，可用分光光度法测定可溶性蛋白的含量。三、材料、设备和原理1.材料 马铃薯提取液2.设备 分光光度计、10ml刻度试管、移液管3.试剂 考马斯蓝G-250、100g/ml标准蛋白液四、操作方法1. 标准曲线制作在各试管中加考马斯蓝G-250，摇匀即：在6支试管中分别加蛋白液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,并加蒸馏水以100g标准蛋白液为母液配制成0、20、40、60、80、100的系列浓度蛋白液在595nm下，测定各管吸光度取10ml刻度试管6只以蛋白含量为横轴，A595为纵轴，绘制标准曲线试剂0号1号2号3号4号5号标准蛋白体积/ml0.000.200.400.600.801.00蒸馏水体积/ml1.000.800.600.400.200.00考马斯蓝G-250/ml555555蛋白质含量/mg0204060801002. 样品液测定放于分光光度计中，595nm下测吸光度空白：1mlKH2PO4+5ml考马斯蓝G-250样品液：1ml提取液（0.5ml提取液+0.5ml蒸馏水）+5ml考马斯蓝G-250五、实验结果标准蛋白液的吸光度值浓度（g/ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0A595 0 0.126 0.219 0.344 0.468 0.597计算：实验测得马铃薯提取液的吸光度值为0.106由Y=0.0059x得x=0.106/0.0059=17.97g/ml蛋白含量=mw1000V总V1 =17.970.99561000250.5 =0.902六、讨论1、如果要求严格，最好在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。2、测定中，蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95% 的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。3、其他的测定蛋白质的方法，与考纳斯蓝比色法比较存在的优缺点。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。考马斯亮蓝法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要