总RNA的提取.doc

总RNA的提取作者：未知 转载：admin 来源：食品伙伴网 点击数：4170 更新时间：2007年12月06日 - 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有的提取过程中都有五个关键点，即）：样品细胞或组织的有效破碎；），有效地使核蛋白复合体变性；），对内源酶的有效抑制；）有效地将从和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1),提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2),直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。方法一:总RNA的试剂盒快速提取一些公司推出的总RNA提取试剂盒,可以用来制备咧柿康目捎糜诮獾腞NA。该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。一：仪器恒温水浴,冷冻高速离心机,紫外分光光度计,取液器,电泳仪,电泳槽二：试剂RNA提取试剂盒,0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC),75%乙醇操作步骤 (一):细胞或组织破碎A:微生物材料：发酵天(或对数生长期)的菌体，离心收集菌丝体(动植物材料无需此步处理)：用经DEPC处理的水洗菌丝体次，并尽量除去残存的水：加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA：研磨后的样品转移至ml变性液的容器中匀浆。B:动植物细胞培养材料(适用的样品量为细胞:108)1:细胞或组织培养:按常规方法进行2:深层悬浮培养细胞的破碎:(1)细胞收集:含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中,4,3000g离心5分钟(2)细胞洗涤:上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1PBS缓冲液洗涤,然后4,3000g离心5分钟,(3)细胞破碎:在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液,用无菌处理过的匀浆器匀浆3:表面培养细胞的破碎:(1)确定培养瓶数量,使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108(2)细胞收集:将培养液倒掉,用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次,在培养瓶中加入8毫升预冷变性液,转动培养瓶,使细胞溶解,此时可见粘度加大. (3)用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶,旋转,溶解细胞,再吸入第三个培养瓶,以此类推,直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次,然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液,将所有培养瓶洗一次. (4)将上述12毫升含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中,匀浆破碎细胞.C:植物组织破碎(适用的样品量为0.05g组织)(1)将600ul变性液置于1.5ml离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟.(2)将0.05g新鲜组织用液氮冰冻(3)在液氮下,研磨组织块(4)待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管中.D:动物组织破碎(适用的样品量为1克组织)(1)将12毫升变性液置于50毫升离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟.(2)在上述管中加入1克新鲜或冰冻动物组织,匀浆粉碎.注1:研磨组织块用于RNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70的冰箱中保存。2:变性液及相应的离心管需预冷(二):RNA的抽提在经变性液匀浆的细胞或组织600ul60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器600ul酚氯仿异戊醇(25241),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒冰裕中10-15分钟, 离心,4，10000g,20分钟上层水相吸至无菌离心管中 等体积的异丙醇,-70,30分钟沉淀RNA离心4，10000g,20分钟沉淀RNA,冷冻干燥15分钟 , RNA沉淀重新溶于300ul变性液中,可振荡(有时为了帮助溶解，可在65加热，但时间应极短)60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器600ul酚氯仿异戊醇(25241),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒冰裕中10-15分钟, 离心,4，10000g,20分钟上层水相吸至无菌离心管中等体积异丙醇二次沉淀(-70,30分钟),乙醇洗沉淀,沉淀冷冻干燥,复溶于去RNA酶的水中(对于准备长期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M，再加入2.5体积的乙醇，保存。)注：1变性液组成：25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mM-巯基乙醇)，65溶解，过滤灭菌，4预冷。2酸性酚配制：55时，500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500ml50mM,pH4.0乙酸钠,直到pH30min;20过夜将有助于增加核酸的沉淀量。9：在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸