酶联免疫吸附法在乳制品中的应用.doc

酶联免疫吸附法在乳制品检测中的应用摘 要: 简单介绍了酶联免疚吸附法（ELISA）,并且就其在乳制品检测中的应用进行了较详细的评述,主要包ELISA用于乳制品中的免疫球蛋白、乳铁蛋白、微生物及其他成分的测定。关健词：酶联免疫吸附法，乳制品，检测Abstract:The enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) were introduced briefly,and application of ELISA in milk products analysis were also studied, including the determination of immunoglobulin, laotoferrin, microorganism, as well as the other components.Keywords: ELISA ,milk products ,determination 1 引言我国的食品安全问题已不再单纯的是一般的质量问题，食品自然甚至人为地污染日趋多样化和复杂化，紧抓食品安全控制成为了关系国计民生的大事，人民和政府的高度重视迫使食品科技不断增加新的检验项目，特别是随着生活质量的提高，人们对于乳制品的需求越来越大，乳制品的安全检测问题也就越发突出。利用新的科技手段不断提高检验水平、质量和效率。现今，食品安全检测正朝着快速、灵敏、简便的方向发展。酶联免疫技术正是迎合了这一方向而被越来越多地应用于乳制品检验领域的。2 酶联免疫吸附法的概述酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunes or bent Assay,简称ELISA),又称酶标法,是在20世纪60年代在免疫荧光和组织化学基础上发展起来的一种新技术， 1966年,Nakane和Avrameas首先用酶标记抗体在普通光学显微镜下定位抗原。1971年,Engvall和Perlman以及Weeman和Schuurs仿照放射免疫测定法(RIA)的竞争性测定原理,使酶标抗原与待测标本中的未标记的抗原,竞争结合一定量的抗体,然后分离游离的和结合的标记抗原,测定酶活性,即可得到待测抗原量。次年,Engvall等改用酶标记免疫球蛋白,提高了标记效率,避免了半抗原标记困难的问题,也简化了操作手续1。目前,ELISA技术已广泛应用在临床医学、兽医学、生物学等领域的检测中,但在食品安全领域中应用相对较少。因此ELISA在食品安全检测中的应用仍有待于进一步的深入研究。由于ELISA检测技术特异性高、灵敏性强,并且食品安全问题日益受到消费者、学术界和各级政府的密切关注,所以ELISA在食品安全检测中的研究和应用也越来越多。本文主要对ELISA法原理、分类及在乳制品检测中的应用进展进行了综述,希望能对ELISA在乳制品检测中的发展起到一定的作用。3 ELISA的测定原理和方法3.1 ELISA的测定原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记, 即利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原或者抗体,使之固相化后，结合在固相载体表面的抗原或抗体既保持其免疫学活性又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开,再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析2。3.2 ELISA 的测定方法及分类ELISA技术可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。ELISA技术主要分为：(1)间接法测定抗体:将特异性抗原包被在固相载体上,从而形成固相抗原, 加入待检样品(含相应抗体),抗体与固相抗原形成抗原-抗体复合物,再加入酶标记的抗抗体(又称二抗)与上述复合物结合,此时加入底物,复合物上的酶则与催化底物反应而显色,由于每步之间均有冲洗步骤。因此,若样品中不含相应的抗体,酶标抗体则将被洗掉,底物不显色而呈阴性反应;若样品中含相应的抗体,底物显色则呈阳性反应。(2)双抗体夹心法测抗原:将已知的特异性抗体包被在固相载体上形成固相抗体,加入待检样品(含相应抗原),其中抗原与固相抗体结合成复合物,再加入特异性的酶标抗体,使之与已形成的抗原-抗体复合物结合, 当加入底物时,酶则催化底物而显色,根据颜色的有无和深浅,对待测抗原进行定性和定量分析。(3)竞争法测抗原:将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体,加入待测样品(含相应抗原)和相应的一定量的酶标抗原,样品中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,待测样品中抗原含量越高,则与固相抗体结合的越多,使得酶标抗原与固相抗体结合的机会就越少,甚至没有机会结合,这样加入底物后就不显色或显色很浅,显色深者为阴性。前面两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原,通常用于临床诊断,而竞争法是测定小分子抗原的方法,适用于食品安全的检测。由于食品安全检测需测定的物质大都是低分子量的,但免疫动物产生抗体的抗原分子量要大(至少50000Da)。因此,首先小分子物质必须结合高分子蛋白质后才能作免疫检测之用。竞争法按实验操作原理的不同又可分成直接竞争法和间接竞争法, 研究者可根据自身的条件和实际要求, 灵活地设计适当的ELISA法。另外还有捕获法测IgM抗体、ABS (avidin biotinsystem) -ELISA法以及PCR- ELISA法和斑点免疫酶结合试验等检测方法3。4 ELISA在乳制品检测的应用4.1 检测免疫球蛋白免疫球蛋白(Immunoglobulin,简称Ig)是一类具有抗体活性且能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白,也是人类体液的一种免疫因子,能杀死细菌和病毒,增强机体的防御能力,人乳 中的Ig含量比牛乳中的Ig含量高,近年来研究人员将Ig用作食品添加剂生产保健食品,如婴儿配方奶粉、乳珍等。常规的蛋白质分析方法无法检测Ig的含量和活性,但大量的研究表明:应用ELISA可以成功的解决这个问题。吴定等4建立ELSIA测定母乳化乳粉中的Ig的含量,结果比较理想。免疫球蛋白是一种热敏感性物质,加工过程中的热处理会减少乳制品中Ig的含量和活性。Ustunol等5-6根据免疫球蛋白Ig与乳链球菌凝集反应的灵敏度,应用ELISA确定IgG 、IgA、 IgM完全失活所需的温度和时间,以便评估和控制热处理过程。4.2 检测乳铁蛋白 乳铁蛋白（Lactoferrin,简称Lf)和免疫球蛋白Ig一样,也是体液中一种免疫因子,具有许多生理活性。抗菌和调整肠胃徽生物类群的作用；刺激和强化铁的吸收；控制铁催化的自由基形成反应的抗氧化作用，以及抗病毒效应等等。在婴儿配方奶粉保健乳粉中，铁蛋白是不可缺少的一种活性成分。张英华7等应用ELISA检测乳铁蛋白的含量,最小检出量为0.5ng*/ml，线性范围0.8ng/ml 100ng/ml，与目前通常采用的高效液相色谱 (HPLC)相比;具有快速、简便、可同时检测几十个甚至几百个试样的优点。*ng 10-9g4.3 检测乳制品中的残留农药药物残留分析从20世纪50年代就开始应用,至今经历了气相色谱法、高效液相色谱法、高效薄层色谱法、超临界流体色谱法、毛细管区域电泳法和免疫分析法。冯秀琼8对1998年前的农药残留分析技术的发展进行了概括; B Gevao等9对近年来农药残留分析的主流方法进行了综述。药物残留分析是复杂的混合物中痕量组分的分析技术,既需要精细的微量操作手段,又需要高灵敏度的痕量检测技术,难度大、仪器化程度和分析成本高,为药物残留分析带来一定难度。随着科技的发展,更多的新技术和方法也将应用于生产实践,如生物传感器方法和荧光免疫法,纳米科技、远红外和中红外也将应用于药物残留的检测中。但所有的这些方法都需要有精密的大型仪器,只能适合于中心实验室或作为确证。高敏感性的快速检测方法和试剂盒则成为保障无残留的最重要的手段。因此,在生产中趋向研究更为灵敏、准确、简便、快速的检测方法,如ELISA检测试剂盒10。王升吉等11论述了免疫分析法在农药残留检测中的应用及前景。农药属于小分子物质,是一种半抗原无免疫原性。所以检测时首先选用竞争法检测农药含量。磺胺及其衍生物是常用的广谱抗菌兽药,广泛应用于乳牛传染病的预防和治疗。含磺胺及其衍生物的乳制品能影响核酸的合成,破坏机体正常菌群生态平衡,对人体健康会产生不良影响。吴定以牛血清蛋白和卵蛋白两种不同的载体包被抗原,建立牛乳中磺胺甲基嘧啶的ELISA测定。Thomson等12也应用ELISA检测牛乳中磺胺噬唑残留量。4.4 检测乳制品中的微生物 微生物检测通常以分离培养、生化试验及血清学试验来进行判定,其步骤烦琐,工作量大,时间长(6-7d ),而应用ELISA检铡微生物的优点正受到人们越来越多的关注。乳制品的营养成分很丰富,非常适合多种类群微生物的生长和繁殖。沙门氏菌是引起细菌性食物中毒的主要致病菌之一,乳制品的微物检验必须包括沙门氏菌这一项。文其乙等13(1996年)实验应用直接ELISA方法对500份蛋品检测,表明方法可靠,且阳性率比国标方法高,经用生化实验进一步验证,确认国标方法存在一定的漏检。目前,多采用制备单克隆抗体的ELISA方法进行检测。有报道称其最低检测量可达500cfu/g,仅需22h,并实现了以ELISA技术为基础的全自动检测14。田银芳等15建立了沙门氏菌的直接ELISA方法,检测350份鲜牛奶样品中的沙门氏菌。作者指出,直接 ELISA的敏感度和特异性都达到满意的效果,且分析时间大大缩短,仅需要2-3d。另外,乳制品中的霉菌也可以应用ELISA检测。例如,Tsai等16就应用ELISA检测奶酪和酸牛奶中常见的青霉、毛霉和曲霉等。4.5 检测乳制品中的毒素黄曲霉毒素是一种致毒性和致癌性很强的毒素,各国都严格限制其在食品中的含量。黄曲霉毒素M1（AFTM1）是由乳牛食用了黄曲霉毒素污染的饲料而引起的,乳制品中的AFTM1含量很低,一般为几十ppt*到几百ppt，常规分析技术难以准确测定其含量。Biancardi用ELISA检测AFTM1的残留量,结果表明,当浓度大于30ppt时,ELISA比高效液相色谱的精确度和准确度高。才琳等17采用黄曲霉毒素M1与牛血清白蛋白偶联物抗原免疫小鼠获得特异性抗体，利用此抗体，进行间接竞争 ELISA 法试验，经过添加回收试验可知，该法可适用于食品卫生监督工作中大量样品的初期筛选检测。组胺既是鱼类食物中毒的主要原因也是“奶酪综合症”的病因。Aygun等18建立直接竞争ELISA分析奶酪中的组胺,分析结果比较理想。*pptparts per trillion，万亿分之一 (10-12)5 ELISA技术的优点及不足与其他检测方法相比：目前用于食品安全检测的方法有很多，如薄层色谱 (TLC)、微生物法、气相色谱（GC）、质谱（MS）、高效液相色谱（HPLC）和核酸探针技术等。TLC 必须进行较为复杂的样品预处理和抽提，且不能定量，灵敏度低。微生物法不易筛选到特别敏感的菌株，也只能定性不能定量，易受其他抗菌药物的影响。GC 及 HPLC 等虽灵敏度高，但设备昂贵，样品预处理复杂，检测费用高，难以推广使用，核酸探针则在实验过程中易受到污染。然而，食品安全检测的发展方向是快速、灵敏、简便。ELISA 分析与其它方法相比，有以下优势：(1)高特异性；(2)高灵敏性，检测范围在ng和pg水平；(3)准确度高、重现性好；(4)一次性可处理大量样品，适宜于用定性试验进行筛选；(5)易于推广到基层。ELISA 分析也存在着一些缺陷，比如：(1)不能同时分析多种成分；(2)对试剂的选择性高；(3)对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。但如果与其它检测手段联合使用，如 GC、HPLC，既可增加检测的灵敏度又可降低交叉反应，还可进行更准确的定量。6 总结我国目前这方面的研究还处于起步阶段，许多试验中我们看到都是引用其他发达国家的试剂盒，而自主创新的很少。值得庆幸的是国内现已有企业生产，如江苏省微生物研究所有限责任公司，现研制的主要产品有黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒、罂粟碱酶联免疫检测试剂盒、盐酸克伦特罗(瘦肉精)酶联免疫检测试剂盒以及磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒等。虽然价格比国外购进的便宜，但是效果还是有待提高。再如有人已将这项技术应用在快速试剂条的研究上，与胶体金结合研制了一种快速检测牛奶中磺胺二甲基嘧啶残留的胶体金试剂条。因此,许多学者致力于改进和完善这种技术,重点在多克隆抗体转向单克隆抗体,纯化抗体和抗原,改进抗体的载体和反应环境,定量方式等几个方面。我们相信随着免疫技术和酶学技术的不断提高，ELISA在乳制品中的应用前景相当广阔。参考文献1程知义,周佳敏编著.酶联免疫标记最新研究进展 M.上海:上海科学技术文献出版社.1984，10（6）：234-2362郭本恒，程玉清等，乳铁蛋白在乳制品中的含量测定，中国乳品工业，1995,23（3）：1171203唐传核，曹劲松等，乳铁蛋白最新研究进展，中国乳品工业，2000,28（3）：14174吴定，张羽航等，乳中磺胺甲基嘧啶残留酶联免疫测定，食品科学，1998,19（2）：42455Z.Ustunol,C.Sypien McAdam D P,et al1Mono-and polyclonal antibodies to the organophosphate fenitrothion121Antibody specificity and assay performance J,J Agric Food Chem, 1992, 40 (8): 147114746Z.Ustunol,C.Sypien Hewedi M M,et al1Monoclonal antibody based ELISA for the detection of ethyl parathion J,J Food Agric Immunol, 1994, 6 (1): 23307张英华，迟玉洁，东平，酶联免疫法测定牛乳中乳铁蛋白含量，中国乳品工业，1999,27（6）：19208冯秀琼,农药残留分析技术进展概况J,农药, 1998, 37 (2): 8109 Gevao B, Semple K T, Jones K C1Bound pesticide residues in soils: a review J1J Environmental Pollution, 2000, 108 (1): 31410刘明生,甘辉群1水产品药物残留的检测监控J1饲料工业, 2006, 27 (10): 515311王升吉,杨崇良,尚佑芬等1免疫分析法在农药残留检测中的应用及前景J1山东农业科学, 2005, (4): 727512C.A.Thomson,P.Sporns Dapeng Wei, Hong Ya