肿瘤干细胞的抗辐射性.docx

肿瘤干细胞的抗辐射性肿瘤干细胞概念在放射生物研究和临床治疗中的应用一、临床放射生物学对肿瘤干细胞的基本认识从1895年伦琴发现X射线至今已过去了100多年，百余年来放射学领域发生了巨大变化。随着放射生物学研究的进展，产生了许多重要的放射生物学研究成果，影响并推动了肿瘤的放射治疗。其中有关肿瘤干细胞的概念及其与放射生物研究和放射治疗的关系至今仍具有不可忽视的影响力。1. 概述多年来的生物学研究已经认识到：在生物体的发育过程中，所有细胞都起源于一个祖细胞(a single progenitor)或受精卵细胞(fertilized oocyte)。随着这个细胞的分裂，子代细胞进入不同的定向分化路径1。在低等有机体，如水螅和涡虫，多潜能的干细胞(the stem cells)遍及全身。因此损伤之后，如肢体、眼或脑的丢失不是致死的，附近的干细胞可以使丢失的结构再生。放射生物学早期对肿瘤干细胞的知识，主要来自对白血病和骨髓细胞的研究。1958年Hewitt 2采用尾静脉注射的方法对同基因型小鼠进行了小鼠白血病移植实验，他不断地对细胞悬液稀释以确定成功接种白血病所需的最小细胞数。他发现成功率与细胞数之间的关系是S形的。认为50%肿瘤的发生概率是3个细胞。在以后的实验中发现这种推测有些天真， 3个或更多的细胞不能合作产生新的肿瘤，曲线的形状也与先前的这种解释不一致。曲线提示所移植的4个细胞中只有1个细胞是产生肿瘤的肿瘤形成单位(tumor forming unit, TFU),它独立于其他3个细胞而产生肿瘤。同样，在CTUs中,1000个骨髓细胞中的一个(1/1000)骨髓干细胞具有完整的再生能力，能生成脾克隆。1961年Till和McCulloch的实验为辨认造血干细胞的功能和特性提供了进一步的依据。用放射线对小鼠进行致死剂量的全身照射后，通过骨髓细胞移植技术他们看到只有极少数的细胞能自我复制并具有广泛的增殖潜能，产生能表达不同分化特征的细胞克隆谱系，一些克隆形成红细胞，而另一些克隆形成粒细胞。这种具有自我复制和广泛增殖潜能的细胞被称为造血干细胞。对造血干细胞及血液系统肿瘤的研究大大推动了对实体肿瘤干细胞的认识。 1970年代以前，放射生物学对人肿瘤细胞增殖的认识主要依据细胞群体动力学的研究，意识到肿瘤细胞群体中的大多数细胞的增殖能力不是无限的，认为进一步的深入研究应着眼于具有无限增殖潜能的特殊细胞亚群(既干细胞亚群)。为此，提出了肿瘤干细胞的概念。2. 肿瘤干细胞的概念：多数放射生物学者认为用“细胞更新的等级制约(cell renewal hierarchy)”概念和肿瘤生长的干细胞模型可以比较好的解释肿瘤干细胞的概念以及与实体肿瘤治疗反应性的关系。1)细胞更新的等级制约(cell renewal hierarchy)大多数放射生物学者认为：大部分人类实体肿瘤源于不断更新的上皮组织，在上皮组织中细胞的丢失是一个正常的过程，即组织内分化的功能细胞持续不断地被更原始的细胞的增殖所取代，这个过程称为细胞更新的等级制约，也称为细胞更新的等级制约系统。大多数上皮来源的肿瘤组织不同程度地保留了这种特性。在这个系统中，干细胞处于关键位置具有两个主要功能，第一，自我更新(self renewal )，这是干细胞的主要特性；第二，启动细胞的初次分裂及其子代细胞群的分化过程，这个过程称为克隆膨胀(clonal expansion)。在细胞更新等级制约系统内部，细胞呈连续的、无序的等级变化。当细胞进入下一个分化层次时，逐步呈现与组织特异功能相关的分化特征。随着细胞分化过程的不断进行，细胞的增殖潜力逐渐丢失。在细胞更新等级制约系统的两端分别是具有最大增殖潜力的干细胞和丧失增殖能力的终末分化细胞。两者间是中间层次的细胞，它们构成肿瘤组织的主要成分。由于缺乏明确的、清楚的标志物可以辨认干细胞，因此经典干细胞概念是一个功能性的概念。2)人肿瘤生长的干细胞模型( The stem cell model of human tumor growth)Mackillop 等3在1983年提出了人肿瘤生长的干细胞模型，这个模型是以肿瘤细胞克隆形成分析(clonogenic assay)实验为基础的，主要目的是将细胞更新理论用以解释人肿瘤的生长，以加深对现代实验技术和肿瘤细胞克隆形成分析实验的理解。(1)模型的理论前提根据细胞更新的等级制约理论，假定在肿瘤组织的细胞群体中有3类细胞，不增殖的终末分化细胞(end cells)；增殖,但没有自我更新能力的转化细胞(transitional cells)；增殖，且有自我更新能力的细胞，即干细胞(stem cells)。(2)影响肿瘤细胞群干细胞比例的因素根据上述基本概念，可以认为：肿瘤组织的细胞群体是由具有无限增殖潜能的干细胞、具有有限增殖能力的非干细胞以及没有增殖能力的终末细胞构成的异质性细胞群体。有4种因素可以影响这些细胞亚群的大小，干细胞自我更新的概率()；转化细胞进一步分裂的潜力，它被定义为克隆膨胀数；每个亚群细胞丢失的相对效率，用细胞丢失因子表示(，,)；单个干细胞增殖的代数。(3)人肿瘤生长的干细胞模型：人肿瘤生长的干细胞模型的基本特征通过以下假设及简单举例予以说明：1） 存在3个主要细胞类型，干细胞(S)，转化细胞()和终末细胞()。2） 只有干细胞具有自我更新能力，自我更新可在每次干细胞的分裂中产生，概率为，产生2个新的干细胞。3） 存在着转化细胞的亚类，第一亚类由干细胞的分裂产生， 两个新细胞的概率为=1-，细胞通过次正确的细胞分裂进行克隆膨胀，每次分裂产生新的转化细胞亚类。 PS 4） 终末细胞不能增殖，只能由转化细胞产生，是克隆膨胀的最终结果。5） 所有具有增殖能力的细胞具有相同的代际时间(generation time )。6） 统计学波动忽略不计，因此是随机变量，每类细胞数可用他们的期望值辨认。7） 起始时间t=0，干细胞数S=0，没有终末或转化细胞存在。因此T(0)=EC(0)=0.8） 干细胞的自我更新概率，在给定细胞群的所有干细胞是相同的。9） 对给定细胞群而言，克隆膨胀数n是一常数，并独立于P 。10） 每代可能来自干细胞、转化细胞或终末细胞亚群的细胞丢失概率，分别是，, 。此概率在每个细胞亚群内的所有细胞是相同的，令：11） 在设定情况下，整个肿瘤生长期间概率，,，克隆膨胀数n以及代际时间是常数。在这个模型中时间变量，是指固定代际时间的总倍增，每个细胞类型的期望细胞数由下式给出： (1) (2) ( 3) . . (4) (5) 每个代际时间以后，细胞进程的每个组群 贯穿后续的转化细胞亚群，直至终末细胞的形成。所累积的最终数目，就是完成n次分裂转化细胞每个组群与新增终末细胞之和。任意时间的每个细胞类型的细胞数可通过替换得到，如等式1与等式2以及等式2与等式3，0和t 之间的所有时间间隔可被代入计算，令得到： (6) (7) . (8) . (9) 等式(6)和(8)用于计算每个亚群的转化细胞数，如果 ，则。如果 ,则转化细胞的总数为： (10) 如果是终末细胞总数，则： (11) 对大的值，干细胞数和细胞总数平行增加，从而在等式中达到平衡，因此，它也可表示为:于是： (12) 由等式(12)的倒数，得到干细胞与总细胞的比例。 (13)二、肿瘤干细胞对放射治疗的反应性临床放射生物学对肿瘤干细胞治疗反应性的认识主要源于两项重要实验技术的发展，1)体外培养细胞的克隆形成分析(clonogenic assay)，2)采用放射自显影术(autoradiography)进行的细胞动力学研究。1956年Puck 和Marcus用Hela S3细胞通过细胞克隆形成分析技术绘制了第一条体外培养肿瘤细胞的细胞放射存活曲线，定量研究和评估放射线对细胞增殖能力的影响，用以反映和推测放射线对肿瘤的控制效果。1. 细胞存活曲线：1)细胞存活曲线的概念：毫无疑问，放射线照射后可以引起大量细胞的死亡，但放射治疗却对受照射后的“存活细胞”更加关注，因这对放射可治愈性非常重要。细胞存活曲线(cell survival curves)：是描述放射线照射剂量和细胞存活分数(surviving fraction)之间的关系，用以研究和评估电离辐射对哺乳动物细胞增殖能力(即再繁殖完整性,reproductive integrity)的影响，对放射生物学研究和临床放射治疗具有重要意义。讨论细胞存活曲线的意义，首先必须明确“细胞存活”的含意，即什麽叫“细胞存活”。对什麽叫细胞的存活与死亡，不同学科根据所研究的内容赋予了不同定义。因为临床放射治疗的目的是抑制肿瘤的继续生长、阻止肿瘤细胞的繁殖传代，因此放射生物学规定：鉴别细胞存活的唯一标准是，受照射后细胞是否保留无限增殖的能力，即是否具有再繁殖完整性。在离体培养细胞实验体系中，细胞群受照射后，一个存活的细胞可以分裂繁殖成一个细胞群体(50个细胞)，称为“克隆(clone)”。这种具有生成“克隆”能力的原始存活细胞，称为“克隆源性细胞(clonogenic cell)。当然，这个定义是指那些正处于增殖状态的细胞而言的，对于那些不再增殖的已分化的细胞，如神经细胞、肌肉细胞、分泌细胞，只要丧失其特殊机能便是死亡。如果细胞在受照射后，形态完整、表面毫无损伤、有能力制造蛋白质或合成DNA，甚至还能挣扎着进行一次或少数几次有丝分裂，但由于已经失去了无限分裂和产生大量子代细胞的能力，故依然被认为是死亡细胞。2)细胞存活曲线的临床意义：首先，它反映和推测的是肿瘤治疗的效果，是从实验角度评估疗效的较好指标；其次，在这个严格定义下，提示临床必须重视这种存活的克隆源细胞(干细胞)，这种具有近乎无限增殖能力的细胞是在治疗中必须根除的细胞，否则将留下复发和转移的隐患。而如何能更有效地消灭这种细胞则是临床放射生物和治疗学家多年来所需要共同关注和加以研究的。3)细胞存活曲线的形状：细胞存活曲线的形状随研究对象(细菌、酵母、哺乳动物细胞)的不同而改变，曲线还会受多种因素的影响。为更好地拟合哺乳动物细胞的存活曲线，已有不少生物数学研究者提出了数种数学模型，在此仅介绍在临床放射生物学研究中最常用的数学模型。(1)指数存活曲线：对于致密电离辐射(如中子、a粒子)，照射后它们的细胞存活曲线用单靶单击数学模型(是靶学说最基本的数学表达式)拟合后，在半对数坐标上是一条直线，呈指数型。其特点是只有一个参数，即值(为斜率的倒数)，通常称为平均致死剂量(mean lethal dose)。它的定义是，平均每靶击中一次所给予的剂量。存活分数()与照射剂量()之间的关系以下列公式表示： (单靶单击模型)或 e为自然对数的底。a是与射线的质和细胞放射敏感性有关的常数。它表明细胞存活率随照射剂量的增加呈指数性下降(亦称指数性失活)。在D0剂量下，平均每靶被击中一次，即 =1 时，。也就是说，细胞群受D0剂量 照射后，并不是所有细胞都受到打击，实际上只有63%的细胞受到致死性击中，而有37%的细胞幸免。(1)非指数存活曲线对稀疏电离辐射(X 、射线等)，照射后的细胞存活曲线的起始部(低剂量段)在半对数坐标上有一个有限的初斜率(即存活分数是照射剂量的指数函数)。在稍高剂量(肩段)，存活曲线出现弯曲，弯曲部分的跨度是几Gy(几百rads)。在高剂量存活曲线又趋于直线(存活分数又变成照射剂量的指数函数)。通常这种情况只在剂量超过了日常放疗剂量时才发生。解释这个现象有许多数学模型和理论，其中最简单和常用的是多靶单击模型(single-hit multi-target model)和线性二次模型。1.多靶单击模型由Elkind 和Whitmore提出，其数学表达式为： 在该模式下，存活曲线由下列参数描述，初始斜率(initial slope)由单一事件的细胞杀灭所致。D1是初始斜率的倒数，指在存活曲线初始部分把细胞存活分数从1.0降到0.37所需的剂量，反映细胞在低剂量区的放射敏感性。终斜率(final slope),由多次事件的细胞杀灭所致。是终斜率的倒数，指在存活曲线的直线部分把细胞存活分数从0.1降到0.037或从0.01降到0.0037所需的剂量。由于存活分数是以对数坐标来标示的，且较高剂量时存活曲线是一直线，因此把细胞群降至一个设定刻度(至0.37)，在所有存活水平所需的剂量都是一样的，它是在每个细胞引起一次致死事件所需的平均剂量(mean lethal dose)。准阈剂量(quasi-threshould dose )，它的定义是，将存活曲线的直线部分反向延长，通过存活分数1.0与剂量轴相交处的剂量。准阈剂量的意思是小于这个剂量将没有效应。早期的文献用来表示细胞对亚致死损伤修复能力的大小，值小，表明细胞的亚致死损伤修复能力弱，很小剂量便可使其进入指数性杀灭。4)外推数(extrapolation number 值)，代表存活曲线肩区宽度的参数。如值大(10或12)该存活曲线的肩区就宽，如值小(1.5-2.0)存活曲线的肩区就窄。早期的文献用N值反映细胞内所含的放射敏感区域(即靶数)，因实验所得的值通常都不是整数，难以说明细胞的靶数。现在只称其为外推数。三个参数之间的关系可用下式表示： 和值三个参数中，任意两个参数便可在一定程度上反映细胞的放射敏感性。 图1 单靶单击和多靶单击模型的细胞存活曲线 2.线性二次模型(linear-quadratic model)用线性二次模型来描述细胞存活曲线，是由描述交换型染色体畸变(由两个独立断裂的相互作用所致)直接发展而来。线性二次模型假设，辐射杀灭细胞有两个部分，一部分与照射剂量成比例，另一部分与照射剂量的平方成比例。据此，细胞存活曲线的表达式为： 是照射剂量为时的细胞存活，和是常数。当 =2或=/时，照射剂量与细胞杀灭成比例的部分与照射剂量平方成比例的部分相等。此点很重要，在这个剂量点(等于和的比值)，线性和平方项对细胞杀灭的贡献是相等的。线性二次公式的特点是，所推导的细胞存活曲线是连续弯曲的，即没有终末的直线部分。这与实验所观察到的不甚吻合，如当细胞杀灭低至7个以上的数量级时，在这种情况下，细胞杀灭是照射剂量的指数函数，其剂量-效应关系在对数坐标上非常接近于直线。然而，在第一个数量级或临床放疗所用的日常剂量范围线性二次公式可以很好地与实验数据拟合。因它的优点是具有和两个参数。 - 图2 线性二次模型的细胞存活曲线 - 3放射治疗过程中的肿瘤干细胞的加速再群体化(Repopulation) 再群体化是指：损伤之后，组织的干细胞在机体调节机制的作用下，增殖、分化、恢复组织原来形态的过程。这一概念早先用于描述正常组织损伤之后的恢复过程。例如，皮肤割伤以后出现了一连串的细胞丢失，数天以后，这个缝隙便被填满了。伤口边缘部位的细胞快速倍增使皮肤的原来的形态得到正确恢复。再群体化效应可以被增殖层次细胞的缺失或非增殖性功能细胞层的缺失所启动。再群体化的概念也用于肿瘤，但涵义有所不同。照射或使用细胞毒性药物以后，可启动肿瘤内存活的干细胞，使之比照射或用药以前分裂得更快，这称之为加速再群体化(accelerated repopulation )。1969年Hermans 等的研究结果说明了这点，图3是单次20Gy X射线照射后大鼠移植瘤肿瘤消退和再生长的总生长曲线。值得重视的是，在这段时间里肿瘤还在明显皱缩和消退着，而存活克隆源细胞的分裂数目比以前更多更快。 _ 图3大鼠横纹肌肉瘤的生长曲线，A.曲线1是未照射的对照组的生长曲线；曲线2是照射后即刻的肿瘤生长曲线；B照射以后不同时间克隆源细胞的比例变化。_ 在临床上，人的肿瘤也存在着相似现象。Withers及其同事总结和分析了头颈部肿瘤达到50%控制剂量(TCD50)与分次治疗总时间的关系，结果见图4。提示，在头颈部肿瘤干细胞的再群体化在开始治疗后的28天左右开始加速。因此每天增加0.6Gy的剂量是需要的，以补偿干细胞加速再群体化所损失的效益。 _ 图4头颈部鳞癌总治疗时间和TCD50剂量的关系 _受照射组织的再群体化反应的启动时间在不同组织之间有所不同。放射治疗期间存活的克隆源性细胞(Clonogenic Cell)的再群体化是造成早反应组织、晚反应组织及肿瘤之间效应差别的重要因素之一。在常规分割放疗期间，大部分早反应组织有一定程度的快速再群体化。而晚反应组织由于它的生物学特性，一般认为疗程中不发生再群体化。如果疗程太长，疗程后期的分次剂量效应将由于肿瘤内存活干细胞已被启动进入快速再群体化而受到损害。正如Withers 的资料中所显示的，头颈部肿瘤在疗程后期(4周左右)出现加速再群体化。因此从生物学角度来看，根据情况对治疗方案进行时间-剂量的必要调整是必要的。在根治性放射治疗，对增殖快的肿瘤应特别注意疗程的时间问题，总治疗时间的延长，因肿瘤干细胞的加速再群体化将会对治疗结果产生不利影响结束语：关于肿瘤干细胞问题，放射生物学家多年前即已开始研究。可以追朔到1950年代。放射生物学早期对肿瘤干细胞的认识主要来自对白血病和骨髓细胞的知识，这方面有许多精辟的论述和实验研究。关于“肿瘤干细胞概念”的经典理论，更是对多年来临床放射生物学研究和放射治疗产生了长远的影响。现代分子生物学研究试图利用分子标志物来对肿瘤干细胞进行直接辨认6 7 ，并对其生物学行为及放射反应性进行研究，如脑胶质瘤、乳腺癌等。近年来也产生了一些研究成果，这是需要密切关注的。但这些现代研究成果与经典理论的衔接以及与临床实践的关联还需不断关注和印证。参考文献1. 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