木聚糖酶检测方法.doc

木聚糖酶活力的测定分光光度法1 原理木聚糖酶能将底物木聚糖（本实验采用Xylan from oat spelt，燕麦木聚糖，Sigma NO. :X0627）降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算待测木聚糖酶的活力。2 木聚糖酶活力单位（U）的定义在40、pH值为5.0的条件下，1.0 min从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 mol还原糖（以木糖表示）所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。其中样品的酶活力以 U / g（固体酶）或U / mL（液体酶）表示。桦木木聚糖（Xylan from birch wood）山毛榉木聚糖（Xylan from beechwood）3 主要仪器3.1 分光光度计3.2 精密电子天平精确至0.0001 g。3.3 恒温水浴锅30-60可调，精度为0.1。3.4 酸度计精确至0.01。3.5 秒表每小时误差不超过5s。3.6 刻度试管（15mL）带玻璃塞，10支以上。3.7 移液管（0.5、1、2、5、10mL）3.8 分样筛孔径为0.25 mm（60目）。3.9 分析天平精确至0.001 g。3.10 磁力搅拌器附加热功能。3.11 电磁振荡器3.12 烧结玻璃过滤器孔径为0.45 m。3.13 离心机3000 r/min3.14 冰箱4 试剂与溶液配制除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。4.1 氢氧化钠（NaOH）溶液（浓度为200 g/L）称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。4.2 乙酸（CH3COOH）溶液（浓度为0.1 mol/L）吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL。4.3 乙酸钠溶液（CH3COONa）（浓度为0.1 mol/L）称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100mL。4.4 乙酸乙酸钠（CH3COOH CH3COONa）缓冲溶液（浓度为0.1 mol/L，pH为5.0）称取三水乙酸钠19.17 g，加入冰乙酸3.60 mL。再加水溶解，定容至2000 mL。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。用精密pH试纸检定。4.5 木糖（C5H10O5）溶液（浓度为10.0 mg/mL）称取无水木糖1.000 g，加乙酸乙酸钠缓冲溶液（4.4）溶解，定容至100 mL。4.6 木聚糖溶液（浓度为10.0g/L）称取木聚糖（Sigma X0627）1.00 g，加入0.32g氢氧化钠，再加入90 mL水，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至木聚糖完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30 min，加入0.8 mL冰乙酸。继续磁力搅拌，测定其pH值。如果pH值为5.0，用乙酸乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100 mL。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0，然后再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100 mL。木聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4避光保存，有效期为3天。4.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g（化学纯），加水500 mL，搅拌5 s，水浴至45。然后逐步加入100 mL氢氧化钠溶液（4.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g。继续45水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4.8 乙酸乙酸钠2号缓冲溶液量取100mL乙酸乙酸钠1号缓冲溶液，加入0.15gTriton X-100（曲拉通100），0.15g牛血清白蛋白（BSA）混合均匀。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。5 标准曲线的绘制吸取乙酸乙酸钠缓冲溶液（4.4）2.0 mL，加入DNS试剂（4.7）3.0 mL，沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，用水定容至15.0 mL，制成标准空白样。分别吸取木糖溶液（4.5）3.00、4.00、5.00、6.00 7.00和8.00mL，分别用缓冲溶液（4.4）定容至100 mL，配制成浓度为300、400、500、600、700、800 g/mL木糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各1.00 mL（做三个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入1.0 mL缓冲液（4.4）（终浓度分别为：0,150，200，250，300，350和400g/mL）和3.0 mL DNS试剂（4.7）。振荡3 s，沸水浴加热5 min。然后用自来水冷却到室温，再用蒸馏水定容至15 mL。以标准空白样为对照调零，在540 nm处测定吸光度OD值。以木糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新表一：木糖标准曲线制作数据记录木糖系列浓度(g/mL)150200250300350400OD540nm1号管2号管3号管平均用EXCEL 线性回归，得到回归方程，用于后续酶活力的计算：y(g/mL)=aOD540nm + b -（2）得： a= ； b= .6 试样溶液的制备固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25 mm），称取1.000g样品，精确至0.001 g。加入40 mL乙酸乙酸钠缓冲溶液（4.4）。高速磁力搅拌30 min，再用缓冲溶液（4.4）定容至100 mL。上离心机（3.13）4000r离心3min，取上清液，再用缓冲溶液（4.4）做适当稀释（吸光度OD540nm值应控制在0.2-0.6之间，否则需重新稀释再做）。（注：当以麸皮或玉米芯份做载体的样品时，应使用乙酸乙酸钠2号缓冲溶液（4.8）抽提，但应使用乙酸乙酸钠1号缓冲溶液（4.4）稀释。）液体样品可以直接用乙酸乙酸钠缓冲溶液（4.4）进行稀释、定容（稀释后吸光度在0.2-0.6之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.0，需要用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节校正至5.0，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。7 测定步骤吸取10.0 mL木聚糖溶液（5.6），40平衡10 min。吸取10.0 mL经过适当稀释的酶液，40平衡10 min。酶空白样制作：吸取1.00 mL经过适当稀释的酶液（已经过40平衡），加入到刻度试管中，再加入3mL DNS试剂（4.7），电磁振荡3 s。然后加入1.0 mL木聚糖溶液（4.6），40反应20 min，沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，加水定容至15 mL，电磁振荡3 s。以此作为反应空白调零。酶反应样制作（需作3个平行）：吸取1.00 mL经过适当稀释的酶液（已经过40平衡），加入到刻度试管中，再加入1.0 mL木聚糖（4.6）（已经过40平衡），电磁振荡3 s，40精确保温20 min。加入3.0 mL DNS试剂（4.7），电磁振荡3 s，以终止酶解反应。沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至15 mL，电磁振荡3 s。以酶空白样为调零，在540 nm处测定吸光度A。跟据回归方程计算出还原糖量，即y值。8 试样酶活的计算 Y N 2XD = （2） 20 150XD 试样稀释液中木聚糖酶的活力，U/mL或者U/g；Y 根据样品吸光度OD540nm，用回归方程计算出的还原糖量（即y值），单位为：g/mL；N 从固体样品到测定前最终液的总稀释倍数；2 酶促反应体积为2.0 mL。15