SDS-PAGE(聚丙烯凝胶电泳)常见问题及解决方案..doc

SDS-PAGE(聚丙烯凝胶电泳)常见问题及解决方案. 导读：1.配胶缓冲液系统对电泳的影响?在 SDS-PAGE 不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是 Tris-HCL 缓冲系统,浓缩胶 是 pH6.7,分离胶 pH8.9;而电泳缓冲液使用的 Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其 pH 环境呈图 1 大肠杆菌全蛋白的sds-page电泳 fig coloration of total1.配胶缓冲液系统对电泳的影响?在 SDS-PAGE 不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是 Tris-HCL 缓冲系统,浓缩胶 是 pH6.7,分离胶 pH8.9;而电泳缓冲液使用的 Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其 pH 环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而 CL 离子 却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电 性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一 起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中 pH 的增加,呈碱性,甘氨酸 大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的 作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以,pH 对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不 能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。2.样品如何处理?根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原 SDS 处理、非还原 SDS 处 理、带有烷基化作用的还原 SDS 处理。1 还原 SDS 处理:在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT(或 Beta 巯基乙醇后,蛋白质 构象被解离,电荷被中和,形成 SDS 与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来 分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样 Buffer,离心,沸水煮 5min,再离心加样。2 带有烷基化作用的还原 SDS 处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久 牢固的保护 SH 基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT,而防止银染时 的纹理现象。100ul 样品缓冲液中 10ul20%的碘乙酸胺,并在室温保温 30min。3 非还原 SDS 处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用 1%SDS 沸水中煮 3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。3.SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用?聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系 到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;制胶缓冲液:浓缩胶选择 pH6.7,分离胶选择 pH8.9,选择 tris-HCL 系统,TEMED 与 AP:AP 提供自由基,TEMED 是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行;十二烷基 硫酸钠(SDS:阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消 蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4.提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径?聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后, 可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置,前者易导致凝固不充 分,后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天,SDS 可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的 染色方法,具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。5.“微笑”(两边翘起中间凹下形带原因?主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。处理办法:待其充分凝固再作后续实验。6.“皱眉”(两边向下中间鼓起形带原因?主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干 净。处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。7.为什么带出现拖尾现象?主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液 时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。8.为什么带出现纹理现象?主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。9.什么是“鬼带”,如何处理?“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在 浓缩胶中的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过 程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔 合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条 带有相同的免疫学活性,在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇,以补充不足的还 原剂;或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。10.为什么溴酚蓝不能起到指示作用?我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主 要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法:更换正确 pH 值的 Buffer;降低分离胶的浓度。11.为什么电泳的条带很粗?电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的 pH 正确(6.7;适当降低电 压;12.为什么电泳电压很高而电流却很低呢?这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上,可电流却在 5mA 以下。主要 是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c. 电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮。处理办法:电泳槽正确装配即可。13.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳 子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入 引起的。14.凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事?通常胶在 30MIN-1H 内凝。如果凝的太慢,可能是 TEMED,APS 剂量不够或者 失效。APS 应该现配现用,TEMED 不