总DNA的提取.doc

第二章 材料与方法2.2总DNA的提取 土壤中存在着大量的腐植酸、蛋白质等杂质都将会影响以下实验步骤，而过多的纯化的步骤又会造成DNA的大量损失和DNA片段的破碎。土壤总DNA的质量直接决定实验着是否能够准确的反应微生物的实际群落组成结构，实验证明不同提取方法获得的DNA，经DGGE分析会产生不同的群落结构指纹图谱Error! Reference source not found.，因此选用合适的DNA 提取方法是十分重要的；，所以必须在在DNA的质量和纯度上做出最佳的平衡选择，Krsek和Welington Error! Reference source not found.认为玻珠+溶菌酶+SDS的组合可从土壤中获较高产量和纯度的DNA。直接提取法参照Krsek和Welington Error! Reference source not found.的试验方法并略作改变，具体使用试剂和步骤方法如下：实验试剂：DNA提取液（1%(W/V) CTAB(十六烷基三乙基溴化铵) 1.5mol/lNaCl、100mM磷酸钠、100mM Tris-HCl、100mM EDTA、PH=8）；20mg/ml蛋白酶K；50mg/ml溶菌酶；10%SDS；饱和酚；酚/氯仿/异戊醇(25：24：1 V/+V)；氯仿；100%乙醇；70%乙醇；异丙醇。提取步骤：1.称取1g土样放入2.0 mL EP管中，然后加入1 mL提取缓冲液混匀，在细胞裂解过程中将所提取样品于液氮和65水浴中反复冻融2次；2.加入溶菌酶(终浓度5mg/ml) 和蛋白酶K（终浓度0.2 mg/mL），并加入终浓度为1的SDS混合均匀，在65 水浴中放置60 min，期间每20 min颠倒混匀一次，12,000 rpm离心20 min，小心的将上清液转移到另一个干净的EP管中；3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒EP管混匀，12,000rpm 离心10 分钟，将上清液转入另一洁净的EP管中；4.在上清液中加入等体积的氯仿，上下颠倒EP管混匀，12,000 rpm离心10min，将上清液转入另一洁净的EP管中；5.加入0.6倍体积预冷的异丙醇，上下颠倒EP管混匀，并在-20放置1小时，12,000 rpm室温离心15min；6.小心的弃去上清，使用75%乙醇洗涤沉淀两次，在室温下自然干燥，用50l灭菌双蒸水或TE缓冲液重悬DNA 沉淀，充分溶解后放入80 冰箱保存。试剂盒提取方法和步骤参照说明书进行，所提取DNA放入80 冰箱保存。2.3 电泳检测琼脂糖凝胶电泳是一种常规的DNA检测方法，根据凝胶浓度、电泳时间和电压大小的不同，可以有效分离0.1Kb-60Kb之间的DNA片段。实验试剂：琼脂糖；1TAE 电泳缓冲液（TAE：0.04 M Tris-醋酸，0.001 M EDTA）；EB (Ethidium bromide，溴化乙锭)溶液或GeneFinderTM染料(Bio-V公司)等核酸染料。实验步骤：1. 称取0.8g-1.5g琼脂糖（视实验所需分离DNA片段大小而定）加入到三角瓶中，加入100ml 1TAE 溶液，于微波炉中加热，稍待冷却后，倒入已插上样品梳的凝胶槽中；2. 水平放置等待琼脂糖凝固，小心拔出梳子，将凝胶连同凝胶槽一同放入已校准水平的电泳槽中，电泳槽中加入1TAE电泳液缓冲液，高于凝胶表面约0.5cm为适；3. 将含有指示剂的DNA样品和DNA Maker分别加入点样孔后接通电源，设定电压和电泳时间（视实验所需分离DNA片段大小和凝胶大小而定）；表2-1 凝胶浓度与DNA片段大小的关系Table 2-1 The gel concentration used for various length of DNA fragment琼脂糖凝胶浓度（%）线性DNA分子的有效分离范围（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-34.一般电泳至指示剂离胶前沿1/3处时结束电泳（视DNA片段大小而定），关闭电源，将凝胶放入染色液中染色（如使用EB，操作时应带乳胶手套操作），在紫外成像仪上成像并拍照。2.4 DNA的纯化对于手工方法提取的土壤总DNA中含有较多杂质，直接进行PCR扩增效果较差，因此对DNA样品进行纯化处理，本试验纯化采用琼脂糖割胶回收或电洗脱法对DNA进行纯化，电洗脱法适用于回收大于5Kb的片段效果较好。电洗脱法纯化步骤：1.透析袋的预处理：选取长为1020 cm的透析袋，将透析袋在1mM EDTA（pH8.0）、2%（w/v）NaHCO3溶液中煮沸10分钟，取出透析袋用蒸馏水彻底冲洗，在1mM EDTA溶液中（pH8.0）煮沸10分钟，让透析袋自然冷却，4贮存（贮存期间，要始终让透析袋浸入溶液之中）；使用前，用蒸馏水充分冲洗袋的内外壁（操作时要带手套）；2.将 DNA电泳分离后染色，确定目标片段的位置，使用手术刀片切下含有目的DNA片段的凝胶；将透析袋一端封紧，并将透析袋装满1TAE，然后将所切胶条放入透析袋中，倒掉多余的缓冲液（只留100L左右），夹紧另一端（袋内不能留有气泡）。3.将含有胶的透折袋放在1TAE电泳槽中，4-5 V/cm，2-3小时，DNA被电泳脱到袋子壁上；更换电极，反向电泳30s-1min（关键步骤），使DNA从袋壁返回袋腔；4.打开透析袋，小心地倒出胶周围的电泳缓冲液于一灭菌EP管中，然后用少量1TE冲洗袋壁，并将冲洗液一并吸入EP管中；将透析袋及胶条置于紫外灯下，观察收集是否完全，如有残留，可重复步骤3；5.将收集溶液用苯酚/氯仿和氯仿各抽提一次，加入0.1体积3M醋酸钠，用2倍体积无水乙醇沉淀，70%的乙醇洗2-3次，干燥后溶于适量的灭菌双蒸水或TE缓冲液，所得DNA用0.8的琼脂糖凝胶电泳检测其质量及片段大小并放入80 冰箱保存。琼脂糖割胶回收具体步骤如下：1. 在紫外灯下切下含有目的DNA片段的胶条、称出其质量（m），放入灭菌1.5 mL离心管中，按照mV(mgmL）=11的比例加入相应体积的Binding Buffer；2. 将混合好的溶液物置于5565水浴10min溶解胶块，直至凝胶完全溶解，期间每23 min轻柔混匀一次，若混合液的颜色变为红色或橙色，需加入8.4 L 3M pH5.2的NaAC调整pH值，使混合液颜色变为淡黄色；3. 将混合液转移到套有2 mL收集管的吸附柱中（每次不超过700 L），10000 rpm，2 min，弃去滤出液；4. 以300 L Binding Buffer润洗吸附柱，10000 rpm，2 min，弃去滤出液；5. 向吸附柱中加入700 L SPW Wash Buffer，室温下静置2 min，10000 rpm，2 min，弃去滤出液；重复操作一次；6. 重新组装吸附柱和收集管，10000 rpm，1min（此步不可省略）；7. 将上层吸附柱转移至一新的灭菌1.5ml离心管中，向吸附柱滤膜上加入30 L的Elution Buffer，室温下静置510 min待DNA充分溶解，10000 rpm，2 min；8. 再向吸附柱滤膜上加入20 L的Elution Buffer，室温下静置510 min待DNA充分溶解，10000 rpm，2 min；将两次得到的约50 L含有DNA的Elution Buffer存于20备用。2.5 PCR技术2.5.1细菌16S rDNA V3区的扩增分别以以实验所提取的12个总DNA样品为模板，16S rDNA V3可变区特异性引物Error! Reference source not found.F357和R518-GC（表2-2）扩增土壤微生物16S rDNA V3可变区，其中，GC片段可以提高DGGE条带分离的灵敏度Error! Reference source not found.，引物由上海生工合成；PCR反应体系为25L（表2-3）。表2-2 本研究所用PCR引物Table 2-2 PCR primers in this studyPCR primerSequence(5 - 3)F357-GCCGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAGF357CCTACGGGAGGCAGCAGR518ATTACCGCGGCTGCTGG357F-GC-M13RCAGGAAACAGCTATGACGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG518-AT-M13FGTAAAACGACGGCCAGTAAATAAAATAAAAATGTAAAAAAATTACCGCGGCTGCTGGM13-47CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACRV-MGAGCGGATAACAATTTCACACAGGF27AGAGTTTGATCCTGGCTCA1492rTACCTTGTTACGACTT表2-3 16S rDNA V3区 PCR扩增反应体系组成Table 2-3 Amplification reaction system of 16S rDNA PCR V3组成成分用量F357-GC 0.5LR5180.5L10buffer2.5LdNTPs2L模板DNA1.0LEX Taq DNA 聚合酶0.2LddH2O18.5L扩增程序采用降落PCR(touchdown-PCR，td-PCR)Error! Reference source not found.，使用该方法可以很好的降低由于存在多种DNA模板时引物和模板之间错配产生的非特异性扩增，对于降落PCR，退火温度的选择对PCR特异性的影响极为重要，经过大量的准备试验对比发现，对于本试验样品，将退火起始温度设为65所得到的结果最佳；由于使用通用引物，因此，过多的循环会造成大量的人工产物，本实验通过准备试验对比发现，对于本试验样品25+5的循环数组合得出的实验结果最佳，表现为目标条带较细，引物二聚体不明显；通过大量预试验比较发现模板稀释100倍后，所扩增效果最好。最终得出本实验扩增程序如下：95 5 min94 45 s 65 -55 30 s72 1 min 72 10 min25个循环(退火温度从65降到55，每两个循环退火温度降低1，555个循环PCR扩增产物约为250bp,扩增结果使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。由于扩增模板采用的是土壤总DNA的呼和模板，因此，在扩增时会产生部分假阳性产物，如异源双链Error! Reference source not found.，这会大大影响下一步实验结果，如以降落PCR产物为模板再次进行Reconditioning PCR，可以明显消除PCR产物中存在的异源双链Error! Reference source not found.。PCR反应体系为50L（表2-4）。表2-4 Reconditioning PCR增反应体系组成Table 2-4 Amplification reaction system of Reconditioning PCR组成成分用量F357-GC 1LR5181L10buffer5LdNTPs4LTD-PCR产物5.0LEX Taq DNA 聚合酶0.3LddH2O34LReconditioning PCR扩增程序：95 5 min94 1 min 55 1 min72 1 min 72 10 min5个循环PCR扩增结果使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。2.5.2细菌16S rDNA片段的扩增将所有桉树人工林土壤样品中所提取的总DNA混合后为模板，采用细菌16S rDNA通用引物Error! Reference source not found.F27和R1492（表2-2）扩增土壤微生物16S rDNA，引物由上海生工合成；PCR反应体系为50L（表2-5）。由于PCR扩增存在偏向性，为减小误差，在实验过程中采用平行扩增，即平行扩增3组，扩增后混合PCR产物。表2-5 16S rDNA PCR扩增反应体系组成Table 2-5 Amplification reaction system of 16S rDNA PCR组成成分用量F27 1L1492r1L10buffer5LdNTPs4L模板DNA1.0LDNA 聚合酶0.5LddH2O37.5L扩增程序如下：95 5 min94 45 s 55 30 s72 1 min 72 10 min30个循环PCR扩增产物约为1.5Kb,扩增结果使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。2.6 感受态细胞的制备本实验所制作感受态细胞适用于化学转化法，具体制作方法步骤如下：1. 从80冰箱取出实验室所保存的E.coli菌体进行活化，活化后在LB平板上划线过夜培养；2.从单菌落中挑取一环E.coli菌体，接种于5 mL LB，37 摇床过夜培养，对制作感受态细胞所要使用的移液器、枪头和离心管进行再次灭菌，灭菌前最好将要使用的枪头后端塞入小块棉花，避免移液器中细菌吹入污染培养基；3.从5 mL LB中取1 mL过夜培养的培养液加入100 mL LB的三角瓶中，37 摇床培养至OD600约为0.4（约2小时）时，取出培养基冰上放置10分钟冷却；4.将冷却的菌液转入250 mL离心管，4 4000 rpm离心10分钟，弃上清，加入10 mL预冷的0.1M CaCl2中，小心用枪头吹打将菌块重新悬浮，冰浴25分钟后44000 rpm离心10分钟，弃去上清液；5.再次将菌块重悬浮于10 mL预冷的CaCl2溶液中，冰浴25分钟后44000 rpm离心10分钟，弃去上清液；6.加入1 mL预冷的0.1M CaCl2中，并加入灭菌的60%的甘油至终浓度10%，小心用枪头吹打将菌块重新悬浮，并分装于1.5mlEP管中，每管50 L，验证后放入-80冰箱保存备用（如将分装好的感受态细胞在4下放置1224小时可提高转化效率）。注意：感受态细胞制作过程当中所有操作须在冰上进行且严格要求无菌操作。2.7 DNA的连接和转化2.7.1 DNA的连接本实验DNA的连接使用TaKaRa公司pMD18-T载体试剂盒，具体操作步骤按照说明书上方法进行，在1.5ml EP管中加入所需载体和外源（2-6），轻轻混匀后，放16水浴过夜，最短连接时间为30min，但延长连接时间将提高连接效果。表2-6 DNA连接反应体系组成Table 2-6 Reaction system of DNA link组成成分用量载体DNA 20 ng外源DNA60 ngLigation Mix5 L LddH2Oto 10 L2.7.2质粒DNA的转化本实验采用化学转化法进行质粒DNA的转化，具体操作步骤如下：1. 将以制备好的的化学法感受态细胞从-80冰箱取出，置于冰上融化；2. 待感受态细胞融化后，加入需要转化的质粒DNA 5 L，轻轻混匀后冰浴30min；3. 将混合感受态细胞和质粒的EP管放入42水浴锅水浴热激90秒；4.在冰上放置1-2分钟后，加入200L的LB培养基，37 摇床(125 rpm)振荡培养4560 min；5. 取50-150 L涂布在含相应抗生素的筛选平板上（表2-7），置于37 培养箱培养过夜。表2-7 蓝白筛选平板配方Table 2-7 Bule and white screen formula组成成分用量LB培养基 200mlAMP400L（50mg/ml）X-gal160L（50mg/ml）IPTG80L（100mg/ml）2.8DGGE技术2.8.1 样品制备实验样品为2.5.1所扩增PCR产物，根据样品浓度进行真空干燥浓缩后使用。2.8.2 DGGE所用仪器和相关试剂实验仪器：BIO-RAD公司基因突变电泳检测仪（BIO-RAD DCodeTM Universal Mutation Detection System）；实验试剂：1.50TAE电泳缓冲液（2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L EDTA pH8.0）1L体积：242gTris，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。）；2. 40%丙烯酞胺凝胶贮藏液(Acrylamide/Bis=37.5l)；去离子甲酰胺（formamide （deionized）；尿素（Urea）；N，N，N，N四甲基二乙胺(TEMED)；3.10% 过硫酸铵（APS）10mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL；2.8.3 DGGE凝胶的制备本试验制备为平行胶，这种胶从上至下变性剂的浓度递增，适用于分析大量样品，DGGE凝胶制备步骤如下Error! Reference source not found.：1.首先根据要分离片段大小确定凝胶浓度和变性剂浓度（表2-8），并根据要灌制凝胶的长宽及厚度确定要配置的丙烯酰胺体积，本试验胶板采用1616 cm，厚度1 mm，配置凝胶浓度8的低浓度溶液（30%）和高浓度溶液（60%）各15ml（表2-9）；（注意，由于丙烯酰胺有剧毒，因此以下实验操作必须小心进行，并佩带手套口罩做好自我保护措施）表2-8 凝胶浓度与相对应的最佳分离片断长度Table 2-8 Gel concentration and the corresponding length of separating fragments凝胶浓度片段长度6%30010008%20040010%100300表2-9 8%浓度的变性胶的配方（100ml）Table 2-9 8Gel Denaturing Solution (100 ml)Reagents30% Denaturing Solution60% Denaturing Solution40%Acrylamide/Bis (37.5:1)3 mL3 mL50x TAE buffer0.5 mL0.5 mLformamide (deionized)1.8 mL3.6 mLUrea1.89 g3.78 gddH2O9 mL6 mLTEMED（实验中再加入）10L10L10%APS（实验中再加入）200L200L2.组装平行胶玻璃板。将两块洗好晾干的的玻璃板按照正确的方法组装，注意玻璃板下部和压条必须平行，加紧玻璃时必须平衡用力，否则会出现漏胶或凝胶破裂等现象而导致制胶失败；3.给注射器做好标记，一个为低浓度溶液，一个为高浓度溶液防止实验时拿混，清洗两个注射器和含有“Y”形接口的胶管、针头，确保其中没有凝胶堵塞，清洗后将水排干，把针头用夹子固定在玻璃板顶端并用软管和“Y”形接口相连；4.设置灌胶器，本实验使用灌胶器为伯乐公司原装配套产品，采用齿轮控制，手动灌胶，由于梯度浓度的形成与灌胶速度无关，因此该系统形成的梯度浓度非常准确，并可重复进行，并可以通过滑动杆调节传送不同体积的溶液，本实验设定为14.5，注意，设置值应低于实际凝胶溶液体积；完成以上四部后，应熟悉以下实验步骤，操作时必须严格控制在10分钟之内完成，否则可能会出现凝胶凝结而无法灌胶。5.给低浓度溶液和高浓度溶液中分别加入TEMED和10%APS，注意，每加完一种溶液后应充分混匀再加入另一溶液，加完后混匀，分别吸入标有标记的注射器中，排净注射器中气泡，并将胶溶液推到胶管末端；6.将装有低浓度溶液的注射器固定在灌胶系统注射器固定器上（低浓度一侧），拧紧螺帽固定好注射器，把注射器末端的附加螺杆插入到灌胶系统的小槽中，用同样方法固定高浓度溶液的注射器；7将胶管和“Y”形接口连接，开始灌胶，灌胶时要匀速缓慢的转动齿轮，灌胶结束后插入梳子并迅速用水清洗注射器、胶管和针头，防止堵塞影响下次使用；8.凝胶室温放置60min后，小心拔取梳子；9.在凝胶过程当中可以打开电泳仪电源、回流泵及控温装置，对电泳缓冲液进行预加热，需要注意的是在加热过程中每当要从电泳槽中拿出控温装置时都需要关闭电源2分钟预冷后才能取出。2.8.4 电泳1.将治好的玻璃凝胶夹板用电泳夹具夹好，放入电泳槽中，在两个两个玻璃凝胶夹板中加入1TAE，检查加样孔内是否有残留的凝胶碎片或气泡，可用移液器或小针头冲洗或挑出；2. 打开电泳仪电源、回流泵及控温装置开关，对电泳缓冲液进行加热，本试验设定温度为60，等待温度加入到预定温度时可移去温控装置，关闭电源后迅速在加样孔中加入已和2Gel Loading Dye混合的PCR产物，一般每个加样孔控制在20L以下，防止样品溢出流入其他加样孔；3.点样完毕后将控温装置放回原处，打开电泳仪电源、回流泵及控温装置开关，待电泳缓冲液温度重新升高至设置温度后，设置电泳电压和时间，开始电泳，本实验温度60，电压180伏特，时间4.5小时。4.电泳完毕后关闭电源，待加热器冷却后，再小心的取出凝胶玻璃板，从玻璃板上将凝胶剥离下来，由于凝胶很薄，因此在操作中必须格外小心，防止凝胶破碎。2.8.5 染色本试验染色采用银染法和GeneFinderTM染料染色法。实验试剂：10%醋酸、1%硝酸、硝酸银（AgNO3）、无水碳酸钠（Na2CO3）、甲醛、硫代硫酸钠银染法实验步骤Error! Reference source not found.：1.固定：将从玻璃板上剥离下来凝胶的凝胶放入500ml10%醋酸溶液中固定15 min -30 min，固定过程中可进行缓慢摇动；2.氧化：将固定好的凝胶用去离子水洗涤2次，每次1min，之后放入500ml1%硝酸溶液中氧化5 min；3.染色：将凝胶氧化后用去离子水洗涤1次，1min，之后放入500ml染色液（0.5g AgNO3、0.5mL37%甲醛）中，染色30min，固定过程中缓慢摇动染色液；4.显影：用去离子水将凝胶冲洗后，立即转入500ml显影液中（2.5mg 硫代硫酸钠、0.5mL37%甲醛）进行显色，显色过程当中必须缓慢摇动显色液，使显色更为均匀；5.终止反应：但在显影液中可以看到条带时，立刻取出凝胶放入10%醋酸溶液中5 min终止反应；6.洗涤：将以成像凝胶在去离子水清洗后照相，或做成干胶保存。GeneFinderTM染料染色步骤：将从玻璃板上剥离下来凝胶的凝胶放入GeneFinder染液中浸泡，30min后取出即可。2.8.6 DGGE图谱分析目前对于电泳图谱分析有很多软件，如：BandScan、Gel-Pro analyzer、Quantity One和BandLeader等。本实验DGGE图谱均采用由用Bio-Rad公司的凝胶定量软件Quantity One，版本号为4.6.2，该软件是一款功能很强大、通用性很强的电泳图像定量分析软件，除了支持Bio-Rad 公司的凝胶分析仪获得的数据外，Quantity One 还可以分析8位和16位灰度的TIF 文件；Quantity One 能够直接对黑