根的活力测定(ɑ—萘胺氧化法)与过氧化酶活性的测定(比色法).doc

根的活力测定（萘胺氧化法）与过氧化酶活性的测定（比色法）09050130 浦荷芳 09050128 徐丽丽 09050129 夏顺翔实验一原理：植物根系能氧化萘胺，生成红色的羟基-1-萘胺，并沉淀于有氧化能力的根表面，使这部分根染成红色。根对萘胺的氧化能力与其呼吸强度有密切联系。日本人相见松中认为萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力越强，对萘胺的氧化力也越强，染色也越深。所以既可根据根系表面着色深浅，定性观察并判断根系活力大小，也可通过测定溶液中未被氧化的萘胺的量，以定量测定根系活力。萘胺在酸性环境中可与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成稳定的红色偶氮染料。生成的红色偶氮化合物在PH7.0时在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度法测定光吸收值，从而利用此反应来简介测定溶液中萘胺的量。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同能够条件下进行。目的：掌握萘胺法测定根系活力，观察重金属胁迫对根系活力的影响。仪器与用品：分光光度计 天平 三角烧瓶 量筒 移液管 剪刀 玻棒试剂：1、萘胺溶液：称取10mg萘胺放在烧杯中，先用2mL左右0.95酒精溶解，然后加水定容到200mL，成50ug/mL的溶液。另取150mL 50ug/mL溶液加水定容至300mL,成25ug/mL的萘胺溶液。2、0.1mol/L磷酸缓冲液亚硝酸钠溶液,pH7.0。3、0.01对氨基苯磺酸溶液。步骤：1、取50ug/ml的萘胺和磷酸缓冲液各25ml ，在三角瓶中混匀。将须根系洗净吸干，取0.5g浸入三角瓶。同样取萘胺与磷酸缓冲液各25ml于另一三角瓶，不放根系作为对照。5min后，两瓶各取2ml溶液。然后按照步骤3进行第一次测定。2、将两个三角瓶置于25恒温箱，避光保存60min后，各取2ml，再按照步骤3做第二次测定。3、取2培养液加入10ml水，混匀后顺次加入1ml对氨基苯碳酸钠和1ml亚硝酸钠。混合均匀之后观察颜色变化。再定容至25ml。室温下放置25min于510nm测OD值。4、 作标准曲线：以50ug/mL萘胺为母液，配制40，30，20，10，5，0 ug/mL的溶液各10mL，各取2mL按3反应，测OD值，以OD值为纵坐标，浓度为横坐标做标准曲线，并计算回归方程。5、 分别查对标准曲线或按回归方程计算实验组合对照组实验前后的萘胺浓度。结果：标准曲线如下：萘胺浓度（ug/mL）4030201050OD值082505950431021300940结果分析：标准曲线作做得较好，测定根系活力结果不理想。除去镉浓度为5mg/l外萘胺的生物氧化强度随着镉浓度升高而降低，让人不怎么信服。出现差错的原因可能在于对照组取材的菱角的须根因培养原因而活力较低，濒临死亡边缘。10的因为菱角在镉胁迫下产生一定抗性，根的呼吸强度增强来度过不良环境。而20的数据可能根系在洗净时没有洗干净，一些物质比如某些离子也可以氧化萘胺溶液，造成根系活力强的假象。另外，操作过程中的不规范以及条件的不同（即不同的人在不同时间、不同周围环境或步骤中操作不同等）都是产生误差的原因。萘胺的生物氧化强度（g/gfw*h）= （C1 C1(C2 C2)48mL/2mLW1h 式中：C1、C2 分别表示1h、5min后测对照组OD值查标曲得萘胺浓度 C1、C2分别表示1h、5min后测实验组OD值查标曲得萘胺浓度W 植物鲜重（ g ）组别添加Cd2+的浓度mg/l第一次测定第二次测定萘胺的生物氧化强度（g/gfw*h）对照组实验组对照组实验组第一组004980462051804763610-4第二组5该组同学未测出结果第三组100.490o.4180.4830.34620410-3第四组20038303850415029274410-3实验二原理：过氧化物酶是植物体内普遍存在的，活性较高的一种酶，它与呼吸作用，光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断变化，因此测定这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm处的吸光度变化来测定过氧化物酶活性。目的：掌握比色法测定过氧化物酶活性的原理和方法。材料：新鲜菱角叶片。仪器与用品：分光光度计 研钵 恒温水浴锅 100mL容量瓶 吸管 离心机 秒表 磁力搅拌器试剂：1、愈创木酚 0.3过氧化氢 100mmol/L磷酸缓冲液pH6.0 2、反应混合液：50mL pH6.0磷酸缓冲液+28uL愈创木酚+19 uL过氧化氢（30%）步骤：1、提取酶液2、现配反应混合液3、取两只比色杯，一只加3mL反应液+0.2mL磷酸缓冲液调零。另一只加3mL反应液+0.2mL酶液，立即计时开始测量，每隔10s读数一次，直至OD470nm=1.000.4、计算酶活性大小：过氧化物酶活性(u/gFW.min)= A470 * VT / W * Vs * 0.01 * t式中：A470-反应时间内OD变化值 VT-提取酶液总体积（mL） W-植物鲜重(g) Vs-测定时取用酶液体积(mL) t-反应时间(min)结果：时间(s)0102030405060过氧化物酶活性OD值10387046205410602067407470802303110-2OD值20.170.220.280.350.440.570.7137810-2OD值30600065407100764081008600907214910-2结果分析：过氧化酶活性的测定全班使用的都是新鲜叶片，目的主要是分析误差的产生因素及以后如何尽量避免。我们组做时当时计时不是很准确，过了几秒才开始所以读数偏晚一些。数据线形关系还不错。结果介于两组之间，过氧化物酶活性是303110-2 。我认为各组之间有误差是难免的，即使同一个人做平行两组，结果相信也会有差异。只是误差要在可接受范围内，避免是操作失误引起的。这三组有差别可能是因为：1所取叶片在不同部位，嫩叶与老叶势必不同；2读数时间不够准确；3记录可能有偏差，原