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荧光光谱分析法实验报告一、 实验目的1、 熟悉荧光分光光度计的主要构造，基本原理和使用方法；2、 掌握固相或者液相材料的激发光谱、发射光谱的测试方法；3、 了解固相或者液相材料的量子产率和荧光寿命的测试方法；二、 实验原理1、荧光光谱简介：物质吸收了较短波长的光能，电子被激发跃迁至较高单线态能级，返回到基态时发射较长波长的特征光谱。包括激发光谱和发射光谱。2、荧光光谱测量原理框架图：3、荧光光谱测量的主要依据：朗伯-比尔定律：朗伯比尔定律数学表达式； A=lg(1/T)=Kbc ，A为吸光度,T为透射比,是投射光强度比上入射光强度 c为吸光物质的浓度 b为吸收层厚度 。物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的西光物质时,起其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.。 荧光效率：即荧光量子产率，是指荧光物质吸收光后发射出的荧光光量子数与其所吸收激发光光量子数之比。即荧光效率=发射荧光的光量子数吸收光的光量子数三、 仪器与试剂仪器： F-7000型荧光分光光度计，（容量）容量瓶，吸量管，洗耳球 试剂：SItb/ch四、 操作步骤1、 样品准备2、 打开计算机，先不打开打开荧光光谱测量程序。3、 打开荧光分光光度计主机，预热5min，对荧光分光光度计进行仪器初始化。4、 打开荧光光谱测量程序，将样品放在样品池中待测。 5、 测量, 选择定性扫描模式和测量条件、参数，选择合适的激发和荧光滤波片。（1）三维荧光谱的测试：运行methods，点击“General”选项，把其调节成“3D scan”，点击“Instrument”设置相关的机器参数，一般是把岀射狭缝（ex）和入射狭缝（em）设置成5.0nm，氙灯的负高压（PMT voltage）设置成400，点击“report”把上面的激发光开始的波长，结束的波长和发射光开始的波长和结束的波长设置成和“Instrument”页面上的一样，下面激发波长和发射波长的测试参数设置也是如此。然后运行measure开始测试，测试完成后保存数据。（2）激发光谱的测试：运行methods，点击“General”选项，把其调节成“Wavelength scan”，点击“Instrument”设置相关的机器参数，把“scan mode”设置成Excitaton，输入特定的发射波长，和激发波长的范围，在“report”上把激发波长的范围修改成和“Instrument”一致，然后运行measure开始测试，测试完成后保存数据。（3）发射光谱的测试：运行methods，点击“General”选项，把其调节成“Wavelength scan”，点击“Instrument”设置相关的机器参数，把“scan mode”设置成Emisiion，输入特定的激发波长，和发射波长的范围，在“report”上把发射波长的范围修改成和“Instrument”一致，然后运行measure开始测试，测试完成后保存数据。6、 仪器的关闭：先关闭运行程序，关闭主窗口时会有两个选择，第一个是直接关闭窗口，第二个是先关氙灯再关闭实验窗口，必须选择第二个选项以延长氙灯的使用寿命。然后关闭仪器，如果仪器过热，必须停一段时间再关闭。导出数据关闭计算机，关闭电源。 五、 注意事项1、 定期清理仪器的比色部分，以保持仪器内部的整洁和洁净。2、 样品池的石英窗口不能被划伤。六、 数据处理1 从测得的三维荧光图谱中找到最佳激发波长值和相应最佳发射波长值最佳激发波长值为226nm，最佳发射波长值为543nm2 固定发射波长，扫描得到激发光谱图3 固定激发波长，扫描得到发射光谱图七、 思考解答1试说明激发谱和发射谱之间的关系，并解释荧光分子的最大激发波长和最大发射波长的相互关系？分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。2荧光相对强度与哪些因素有关？为什么？4 解释荧光光