淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的优化.doc

2期 方传记等：淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的优化539淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的优化方传记，陆兆新，孙力军，别小妹，吕凤霞，黄现青（南京农业大学食品科技学院，南京 210095）摘要：【目的】提高淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）发酵产脂肽类抗菌物质的产量。【方法】采用Plackett-Burman Design对影响B. amyloliquefaciens ES-2-4产脂肽类抗菌物质产量的13个因子进行筛选，在筛选结果的基础上，再运用Uniform Design（均匀设计）对关键因子的最佳水平范围进行研究，通过回归方程求解得到最高产量时各关键因子的最优组合。【结果】影响抗菌物质产量的关键因子为葡萄糖、L-谷氨酸钠、转速和温度；获得最佳产量时关键因子的最优组合为：葡萄糖(42 gL-1)、L-谷氨酸钠(14 gL-1)、温度（27）、转速（200r/min），在此条件下，产量从优化前的4.84 gL-1 提高到了6.76 gL-1，增长了39.7%。【结论】B. amyloliquefaciens ES-2-4抗菌脂肽发酵培养基筛选与优化的过程中，采用Plackett-Burman Design和Uniform Design相结合的方法，效果显著，经济有效。关键词：淀粉液化芽孢杆菌；抗菌脂肽；发酵；优化；均匀设计Optimization of Fermentation Technology for Lipopeptides Producing Bacteri a Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4FANG Chuan-ji, LU Zhao-xin, SUN Li-jun, BIE Xiao-mei, L Feng-xia, HUANG Xian-qing(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)Abstract: 【Objective】 Research technology was explored is to increase the yield of lipopeptides produced by bacteri a Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4. 【Method】Plackett-Burman Design was used to evaluate the effect of the thirteen factors. In the following phase of the optimization process, Uniform Design was applied to get the optimum composition of the crucial factors. 【Result】By statistical analysis, the significant factors affecting the yield of the antimicrobial substance were determined as follows: glucose, L-monosodium glutamate, temperature, rotated speed. And the optimal composition was 42 gL-1glucose, 14 gL-1 L-monosodium glutamate, 27 and 200 r/min. The production of the antimicrobial substance increased from 4.84 gL-1 to 6.76 gL-1, which was 39.7% higher than that of the control. 【Conclusion】 Plackett-Burman design and Uniform Design were simultaneously used in the optimization of the fermentation of lipopeptides producing bacteri a B. amyloliquefaciens ES-2-4, which was proved to be effective and economical.Key words: Bacillus amyloliquefaciens; Lipopeptides; Fermentation; Optimization; Uniform Design0 引言【研究意义】细菌耐药性问题日趋严重，对抗药性革兰氏阳性病原菌具有显著抗性的脂肽类抗生素1成为人们研究的焦点。芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌能够产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、类噬菌体颗粒和细菌素等。其中脂肽类抗菌物质包括表面活性素（surfcatin）、伊枯草菌素（iturin）和芬荠素（fengycin）三大类2，具有抗细菌、真菌、病毒和支原体的功能3，在生物医药方面具有重要的应用价值。此外，抗菌脂肽在石油工业、食品、化妆品和农业上也有广泛的应用3,4。然而，较高的生产成本和较低的产量限制了抗菌脂肽的工业化生产，因此寻找能够降低生产成本、提高抗菌脂肽产量的方法是目前迫切需要解决的问题。【前人研究进展】抗菌脂肽的生物合成受发酵培养基组分和发酵条件的影响5。许多试验证明碳源、氮源和微量元素在抗菌脂肽生产的过程中起着关键作用，尤其是微量元素，如Fe2+和Mn2+。最新的研究表明，适量的添加Fe2+和Mn2+能够显著提高抗菌脂肽产量6,7。除此之外，发酵条件如pH、温度、转速和通气量也能够影响抗菌脂肽的生产5。一般在优化过程中常采用数理统计的试验方法，R. Sen等5,8,9采用响应曲面法（response surface methodology）分别对影响surfactin产量的关键培养基组分、发酵条件以及种龄和接种量进行了优化研究。Wei等10则通过Taguchi method（Taguchi法）来优化发酵培养基中微量元素的含量，达到提高产量的目的。【本研究切入点】国内外对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵的优化研究较多，而系统地对淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）液体深层发酵优化的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】均匀设计（Uniform Design）具有显著降低试验组数、能够适合多因素多水平试验设计的优点11，因而可以较好解决上述问题，本研究采用Uniform Design法对B. amyloliquefaciens液体深层发酵产抗菌脂肽类抗菌物质（fengycin类）的发酵工艺进行系统研究，通过合理的试验设计来提高抗菌脂肽产量，减少试验规模，以达到提高产量、降低成本的目标。1 材料与方法1.1 供试菌株及培养基本试验于2006年3月至7月在南京农业大学进行，供试菌株淀粉液化芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）ES-2-4（南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保藏）；种子液体培养基：牛肉浸膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.0；基础发酵培养基：葡萄糖20.0 g，L-谷氨酸钠5.0 g，MgSO4 0.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO4 1 g，FeSO4 0.15 mg，MnSO4 5.0 mg，CuSO4 0.16 mg，蒸馏水1 000 ml，pH 7.0。1.2 培养方法取斜面置于37培养箱活化24 h，从新鲜斜面挑取一环接种于种子培养基（250 ml摇瓶，装液量50 ml），摇床（28, 160 r/min）培养24 h，从种子液中以一定的接种量接种于发酵培养基（250 ml摇瓶，装液量50 ml），在一定的条件下（表1、表2）摇床中培养36 h。1.3 脂肽类抗菌物质的提取提取的方法参考文献12并作了一定的修改：将发酵液于10 000g冷冻离心15 min，取1 ml上清液置于2 ml离心管中，真空浓缩干燥（25），在干燥样品中加入1 ml 70%甲醇水溶液提取20 min，10 000g冷冻离心5 min，离心获得甲醇提取液，提取液再经0.22 m尼龙树脂过滤，过滤后的滤液即脂肽类抗菌物质的粗提液，保存在4冰箱待用。1.4 脂肽类抗菌物质含量的测定定量的方法参考文献13并进行了一定的修改：脂肽类抗菌物质通过HPLC（C18，4.6 mm250 mm0.5 m，AGILENT 1100 series）进行分析检测，流动相为水和乙腈，梯度洗脱（050 min，H2O 100%0，Acetonitrile 0100%），流速为0.2 mlmin-1，紫外检测波长225 nm（G1314A VWD，JP24020513，AGILENT）。脂肽类抗菌物质纯品可以通过HPLC层析获得。峰面积（x）和抗菌物质浓度（y）的标准曲线为：y=4E-05x-0.0004（R2=0.9996）。通过该方程可以计算出脂肽类抗菌物质的质量浓度（gL-1）。1.5 试验设计1.5.1 影响发酵工艺的关键因子筛选 采用Plackett-Burman Design14分别对影响发酵工艺的13个因子进行筛选，其中X1X8为发酵培养基组分，X9X13为发酵条件。试验设计和数据分析皆采用JMP软件（version 4.0.5，SAS Institute Inc.），每组试验3次重复，结果取平均值。试验设计及结果见表1。1.5.2 发酵工艺的优化设计 采用均匀试验设计表U15（15252）对筛选出的4个关键因子：葡萄糖（x1，15水平）、L-谷氨酸钠（x2，15水平）、温度（x3，5水平）、转速（x4，5水平）进行混合均匀设计。各因子的取值范围分别为：0x142 gL-1、0x214 gL-1、26x338、120 r/minx4200 r/min，响应值为脂肽类抗菌物质含量。试验结果为3次重复的平均值，数据的分析和二次多项式回归方程的建立均采用DPS数据处理系统15。均匀设计因素水平编码见表2。2 结果与分析2.1 影响抗菌脂肽产量的关键因子通过JMP软件（version 4.0.5，SAS Institute Inc.）表1 Plackett-Burman 试验设计表及结果Table 1 Table of Plackett-Burman Design and the results试验编号Trial No.葡萄糖(gL-1)GlucoseX1L-谷氨酸钠(gL-1)L-monosodium glutamate X2MgSO4(gL-1)X3KCl(gL-1)X4KH2PO4(gL-1)X5FeSO4(mgL-1)X6MnSO4(mgL-1)X7CuSO4(mgL-1)X8温度()Temp.X9pHX10接种量(%)Inoculum sizeX11转速(r/min)Rotated speedX12装液量(ml)Broth contentX13抗菌脂肽产量(gL-1)Yield of lipopeptidesY11(27)1111111111111.206 2-1(18)1(6)-1-11111-11-11-11.340 3-1-1(4)1(0.6)-1-11111-11-110.900 41-1-1(0.4)1(0.6)-1-11111-11-11.227 511-1-1(0.4)1(1.2)-1-11111-111.022 6-111-1-1(0.8)1(0.15)-1-11111-11.222 7-1-111-1-1(0.1)1(6)-1-111111.006 8-1-1-111-1-1(4)1(0.15)-1-11111.012 9-1-1-1-111-1-1(0.1)1(32)-1-1111.012 101-1-1-1-111-1-1(28)1(7.5)-1-111.001 11-11-1-1-1-111-1-1(6.5)1(6)-1-11.277 121-11-1-1-1-111-1-1(4)1(180)-11.383 13-11-11-1-1-1-111-1-1(150)1(60)0.934 141-11-11-1-1-1-111-1-1(40)1.264 1511-11-11-1-1-1-111-11.530 16111-11-11-1-1-1-1111.310 171111-11-11-1-1-1-111.237 18-11111-11-11-1-1-1-11.049 19-1-11111-11-11-1-1-11.169 201-1-11111-11-11-1-11.101 表2 均匀设计因素水平编码表Table 2 Factors and levels of the Uniform Design U15 (15252)试验编号 Trial No.葡萄糖 Glucose x1L-谷氨酸钠 L-monosodium glutamate x2温度 Temp. x3转速Rotated speed x4116242324231313447455551235612915768318831391052110157421121053121413231341412141111511591544对Plackett-Burman Design设计的试验（表2）进行数据分析，通过方差分析得到影响抗菌脂肽产量的各因素的效应评价结果（表3）。共有5个因素达到极其显著水平（P0.01），显著程度从大到小依次为：装液量（P=0.0002）、葡萄糖（P=0.0014）、转速（P=0.0018）、温度（P=0.0043）、L-谷氨酸钠（P=0.0051），其它各因素均不显著（P0.05）。因此，以上5个因素为影响B. amyloliquefaciens ES-2-4产脂肽类抗菌物质发酵工艺的关键因子。从各因素对抗菌脂肽的影响来看（图），葡萄糖（X1）、L-谷氨酸钠（X2）、转速（X12）与抗菌脂肽的产量均呈正相关，而温度（X9）和装液量（X13）呈负相关。本试验中低水平（-1）和高水平（1）的金属离子浓度对抗菌脂肽产量的影响很小，说明这些因素的水平范围接近最优值。2.2 发酵工艺的优化表3 各因素的效应评价Table 3 Effect tests of the factors influcing the yield of lipopeptides方差来源Variance source自由度df平方和Sum of squares均方Mean squareF值F valuesProbFX11.0001.61991.619931.07030.0014X21.0000.96710.967118.54920.0051X31.0000.07340.07341.40870.2801X41.0000.05900.05901.1310.3285X51.0000.04760.04760.91350.3761X61.0000.04740.04740.90980.377X71.0000.11890.11892.28030.1818X81.0000.10340.10341.9830.2087X91.0001.03691.036919.88850.0043X101.0000.15170.15172.91010.1389X111.0000.01290.01290.24750.6366X121.0001.46231.462328.04710.0018X131.0003.22243.222461.80590.0002图 抗菌脂肽产量预测趋势图Fig. Prediction profile for the yield of lipopeptides2.2.1 均匀设计及其回归方程的建立 均匀试验设计及其响应值见表4，所使用的二次多项式模型为： （1）利用DPS数据处理软件对表4中的数据进行二次多项式逐步回归分析，得到方程：y=35.247-0.286x2-1.586x3-0.073x4+0.0003x12-0.0156x22+0.0195x32+0.005x1x2+0.003x2x4+0.0015x3x4R2=0.958；F=18.157，P=0.0026 （2）方差分析的结果（P=0.0026）说明回归方程极其显著；相关系数为0.958，表明该方程的预测值与实际值之间拟合度好（表5），能够很好体现脂肽类抗菌物质生产过程中各因素与产量之间的关系。因而，选取该方程为优化所用的方程。2.2.2 最优发酵工艺 利用上述建立的回归方程方程（2），通过DPS软件处理得出最优发酵工艺为：葡萄糖42 gL-1、L-谷氨酸钠14 gL-1、温度27、转速200 r/min，其它各因素的取值分别为：MgSO4 0.5表4 均匀设计及其响应值Table 4 The design of Uniform Design and responding results试验编号Trial No.葡萄糖 (gL-1)Glucose x1L-谷氨酸钠 (gL-1)L-monosodium glutamate x2温度 ()Temp. x3 转速 (r/min)Rotated speed x4 抗菌脂肽产量 (gL-1)Yield of lipopeptides y105291801.283 261351401.049 3360321800.565 4183382001.185 51211322001.867 6338262003.757 7157321201.6338212261602.1749274291203.31210426351402.6761139381601.353123912291604.13013913261402.227143010381202.366152414351802.196培养基中其它组分为：MgSO4 0.5 gL-1、KCl 0.5 gL-1、KH2PO4 1 gL-1、FeSO4 0.15 mgL-1、MnSO4 5.0 mgL-1、CuSO4 0.16 mgL-1，pH 7.0，接种量4%，装液量50 ml/250 ml，发酵时间36 hThe other elements of the fermentation media are as follows: MgSO4 0.5 gL-1 gL-1、KCl 0.5 gL-1、KH2PO4 1 gL-1、FeSO4 0.15 mgL-1、MnSO4 5.0 mgL-1、CuSO4 0.16 mgL-1, pH 7.0, inoculum size 4%, broth content 50 ml/250 ml, fermentation time 36 h表5 抗菌脂肽产量的实测值和模型预测值Table 5 Actual and predicted values for the yield of lipopeptides试验编号Trial No.实测值Observed values预测值Predicted values误差Errors11.283 1.2750.008 21.049 0.9560.093 30.565 0.4730.092 41.185 1.1760.009 51.867 1.8110.056 63.757 3.6840.073 71.6331.868-0.235 82.1742.491-0.317 93.3123.0020.310 102.6762.942-0.266 111.3531.2550.098 124.133.9650.165 132.2272.210.017 142.3662.2740.092 152.1962.391-0.195 gL-1、KCl 0.5 gL-1、KH2PO4 1 gL-1、FeSO4 0.15 mgL-1、MnSO4 5.0 mgL-1、CuSO4 0.16 mgL-1，pH 7.0，接种量4%，装液量50 ml/250 ml，摇床中培养36 h。此时获得的最高产量为6.76 gL-1，而使用对照（基础发酵培养基见1.1，发酵条件：温度28、转速160 r/min，接种量4%，装液量50 ml/250 ml，摇床中培养36 h）获得的产量为4.84 gL-1，优化后比优化前产量提高了39.7%。3 讨论本次试验中，装液量（P=0.0002）对抗菌脂肽产量的影响程度最大，并且具有负效应，即装液量越小，越有利于抗菌脂肽的产生。装液量反映的是通气量的多少，也就是说通气量是影响抗菌物质产量的重要因素；据研究16表明抗菌脂肽是通过非核糖体途径合成的，由组件（modules）组成的多酶复合体催化的，环境因素对抗菌脂肽合成的影响很大，本次试验也证明了这一点。其次为葡萄糖（P=0.0014），葡萄糖是发酵培养基中惟一的碳源，碳源是脂肽类抗菌物质脂肪酸链合成时所必需的，因而对脂肽类抗菌物质的产量也有较大的影响。在实际生产过程中，装液量不能太低，否则会降低生产能力，基于上述原因，在优化的过程中最终只把葡萄糖、L-谷氨酸钠、转速和温度作为影响产量的关键因子。RSM（响应曲面法）是一种优化生物过程的综合技术，能够对影响生物过程的因子水平及其交互作用进行优化和评价，被广泛应用在发酵工程领域17。近些年来，有关抗菌脂肽发酵优化研究的文献中， 研究者们大都采用了响应曲面法。笔者分别从优化效果和试验规模，对RSM和Uniform Design进行了比较。沈娟等18对RSM优化发酵培养基进行了研究，结果表明通过优化，产量从1.30 gml-1提高到了1.49 gml-1，产量提高了14.1%。而本研究中采用Uniform Design优化后，产量从优化前的4.84 gL-1提高到了6.76 gL-1，增长了39.7%，沈娟等18试验设计中，5因素5水平需要32组试验，Ramkrishna与Sen5在surfactin的生产过程中采用RSM（响应曲面法）对发酵条件优化过程中，4因素5水平需要30组试验，而利用均匀设计安排试验4因素15水平仅用了15组试验，试验次数减少了一半。由此可见，与RSM相比，Uniform Design不仅试验规模更小，而且效果更显著，达到了提高产量，降低成本的目标。4 结论本文采用Plackett-Burman Design和均匀设计相结合的方法对B. amyloliquefaciens ES-2-4产脂肽类抗菌物质的液体深层发酵工艺进行了优化，获得最高产量时的液体深层发酵工艺为：葡萄糖42 gL-1、L-谷氨酸钠14 gL-1、MgSO4 0.5 gL-1、KCl 0.5 gL-1、KH2PO4 1 gL-1、FeSO4 0.15 mgL-1、MnSO4 5.0 mgL-1、CuSO4 0.16 mgL-1，pH 7.0，温度27、转速200 r/min，接种量4%，装液量50 ml/250 ml，摇床中培养36 h，此条件下的产量为6.76 gL-1，比优化前提高了39.7%。 此外，通过试验表明Plackett-Burman Design和均匀设计相结合的方法在优化发酵工艺时具有可行性。References1Akins R L, Rybak M J. Bactericidal activities of two daptomycin regimens against clinical strains of glycopeptide intermediate-resistant Staphylococcus aureus, vancomycin-resistant Enterococcus faecium, and methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates in an in vitro pharmacodynamic model with stimulated endocardial vegetations. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001, 45(2): 454-459.2Koumoutsi A, Chen X H, Henne A, Liesegang H, Hitzeroth G, Franke P, Vater J, Borriss R. Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strains FZB42. Journal of Bacteriology, 2004, 186(4): 1084-1096.3Singh P, Cameotra S S. Potential applications of microbial surfactants in biomedical sciences. Trends in Biotechnology, 2004, 22(3): 142-146.4Yeh M S, Wei Y H, Chang J S. Bioreactor design for enhanced carrier-assisted surfactin production with Bacillus subtilis. Process Biochemistry, 2006, 41: 1799-18055Sen R, Swaminathan T. Application of response-surface methodology to evaluate the optimum environmental conditions for the enhanced production of surfactin. Appllied Microbiology and Biotechnology, 1997, 47: 358-363.6Wei Y H, Wang L F, Chang J S, Kung S S. Identification of induced acidification in iron-enriched cultures of Bacillus subtilis during biosurfactant fermentation. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2003, 96(2): 174-178.7Wei Y H, Chu I M. Mn2+ improves production of surfactin by Bacillus subtilis. Biotechnology Letters, 2002, 24: 479-482.8Sen R. Response surface optimization of the critical media components for the production of surfactin. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 1997, 68: 263-270.9Sen R, Swaminathan T. Response surface modeling and optimization to elucidate and analyze the effects of inoculum age and size on surfactin production. Biochemical Engineering Journal, 2004, 21: 141-148.10Wei Y H, Lai C C, Chang J S. Using Taguchi experimental design methods to optimize trace element composition for enhanced surfactin production by Bacillus subtilis ATCC 21332. Process Biochemistry, DOI: 10.1016/cbio.2006.07.025.11Wen S H, Zhang T, Tan T W. Optimization of the amino acid composition in glutathione fermentation. Process Biochemistry, 2005, 40: 3474-3479.12Sun L J, Lu Z X, Bie X M, Lu F X, Yang S Y. Isolation and characterization of a co-producer of fengycins and surfactins, endophytic Bacillus amyloliqu