第14章+细胞工程与作物育种.ppt

第十四章细胞工程与作物育种 1 目的要求 了解植物离体培养的概念 类型及育种应用 初步掌握植物离体培养技术 了解植物原生质体培养与体细胞杂交的基本过程 2 讲授内容 一 细胞工程概述二 植物离体培养技术三 植物原生质体培养与体细胞杂交 一 细胞工程概述 一 细胞工程的定义 以细胞为基本单位 在离体条件下进行培养 繁殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性 以改良作物品种和创造新种质 或加速繁育植物群体或获得其它有经济价值的生物产品的过程 二 主要内容 是现代生物技术的重要组成部分 包括 植物组织培养植物细胞培养花药及花粉培养离体胚培养原生质体培养细胞器移植等等 每一种都还可以继续细分为不同小类 以上内容可归为两部分上游工程 细胞培养 细胞遗传转化体系建立 下游工程 细胞工程实践应用 三 理论基础植物细胞全能性 cellTotipotency 每个植物细胞具有发育成为完整植株的潜能 四 育种应用 1 微体快繁植物组织 块 人工培养 再生成苗 大量繁殖 营养植物 经济作物 如花卉 香蕉 咖啡 中药材品种快繁 荷兰 以色列 花卉 2 脱毒染病毒植物中 茎尖分生组织病毒的分布最少或没有 草莓 香蕉 甘薯 马铃薯等60多种作物 脱毒草莓 左 3 细胞融合 体细胞杂交 克服不同物种有性杂交困难马铃薯与番茄的细胞融合成功获得植株 2个抗病毒马铃薯野生种 2n 2x 24 不能有性杂交 通过细胞融合 获得抗病毒马铃薯 2n 4x 48 4 体细胞无性系变异筛选 基础 生物个体生长发育过程中 体细胞基因突变和染色体重组产生体细胞变异方法 有利的体细胞变异 定向 筛选 培养成苗 培育优良品种应用 日本粳稻品种 胚培养 早熟 优质 高产的粳稻品种在东北大积推广应用 水稻幼胚 毒素培养基 含病原菌的粗毒素 愈伤组织化成苗 经过抗性鉴定 抗稻瘟病品系 5 胚拯救远缘杂交早期胚胎发育到一定时间就停止发育 死亡 夭折 远缘杂种幼胚 离体组织培养 发育正常植株 6 花药 花粉 培养 杂交后代分离 遗传纯合稳定慢 育种周期长 花粉 花药 单倍体 n 二倍体 2n 遗传迅速纯合 育种周期极大缩短 Hs 1 Hs 2 Hs 3系列光敏不育系 花1A 培矮64s花培纯化 解决育性转换临界温度漂移 十字花科蔬菜的自交不亲和系培育 中花8号 水稻 京花3号 小麦 等 花椰菜 抱子甘蓝花药培养 快速培育自交不亲和系 7 创制人工种子人工种皮 胚状体 不定芽 顶芽 腋芽 8 种质试管保存9 转基因受体 二 植物离体培养技术 一 概念1 植物离体培养 Invitroculture 植物外植体在无菌条件下进行人工培养 并使之发育成完整植株的技术总称 也称植物组织培养 Planttissueculture 2 外植体 explant 从植物体分离下来进行培养的器官 组织或细胞等 3 初代培养 Primaryculture 指外植体的最初培养 4 继代培养 Subculture 将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中再培养 一次或多次移植培养 洗涤室灭菌室配制室无菌操作室培养室 暗 光 二 实验室基本设施 组培实验室 要求无菌条件 三 培养条件 1 培养基 1 种类 固体培养基液体培养基 2 基本培养基MS B5 White N6等P237表15 1 MS Murashige Skoog 3 培养基的成分无机营养 大量元素 N P K S Ca Mg微量元素 Fe Mn Cu等有机营养 碳源 蔗糖 葡萄糖 果糖 麦芽糖氮源 氨基酸类 酰胺类活性物质 烟酸 肌醇 生物素等植物激素 生长素类 IAA NAA IBA等细胞分裂素类 激动素 玉米素等其它 赤霉素 脱落酸 乙烯附加物 琼脂 椰乳 水解蛋白等 十字花科花药培养的培养基成分 2 无菌操作 1 污染源培养基及玻璃器皿无菌操作室 器械外植体 2 消毒器皿消毒材料 外植体 消毒 外植体消毒 外植体常用消毒剂的种类 浓度 及效果 培养基灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌接种过程消毒接种室 无菌操作室 的灭菌接种台的灭菌工作人员 3 培养条件 光照 白色荧光灯 光强1000 5000Lx 12 16hr 用自动定时器控制光照时间温度 多为25 2 湿度 容器内湿度 100 环境湿度 要求70 80 4 基本过程 外植体取材 已分化的器官 组织 细胞等 外植体消毒灭菌 接种到相应的脱分化培养基 脱分化 愈伤组织或胚状体 接种到分化培养基 再分化 分化芽 根 完整植株 练苗 移栽大田 胚状体 愈伤组织 水稻花药培养过程 影响花药及花粉培养的因素 供体植株的基因型培养基 基本培养基 附加物 如水稻 小麦用N6 小孢子发育阶段合适发育期的花药 离体培养才能启动花粉发育 实践表明 从减数分裂期至双核期的花药 均有可能诱导离体孤雄发育 大多数园艺植物的花药培养 成功率最高的时期为单核期 或单核中晚期 供体植株的生理状态及培养前预处理 三 原生质体培养与体细胞杂交 植物原生质体 除去细胞壁的由质膜包裹着的具有生活力的裸细胞 原生质体融合 也称体细胞杂交 使不同原生质体相互融合形成杂种细胞 再经过人工培养诱导杂种细胞分化形成植株的过程 一 基本步骤 原生质体分离原生质体培养原生质体融合融合体的发育及杂种细胞的筛选体细胞杂种植株的再生及鉴定 P254 图15 9 二 原生质体分离 分离原生质体的材料叶肉组织 无菌苗的子叶 愈伤组织及悬浮细胞 分离植物原生质体所需的酶果胶酶 纤维素酶原生质体分离步骤一步法 果胶酶和纤维素酶混合处理材料二步法 用果胶酶降解细胞间层使细胞分离 再用纤维素酶水解细胞壁释放原生质体 酶解后 用200目筛过滤 滤液再用400目筛过滤 滤液经低速离心 去上清液后 即为纯化原生质体 纯化后的原生质体 三 原生质体培养 液体浅层培养固 液培养固体包埋培养注意几点 原生质体培养之前必须调到一定的密度 细胞密度 一般以103 105 104 108 个细胞 ml 密度太低原生质体不能分裂 在培养过程中 根据细胞生长情况不断降低渗透压 以促进分裂 一般在暗条件下培养直到愈伤组织形成 暗条件有利于细胞壁形成和细胞再生 愈伤组织形成后 可转移到普通培养基上进行细胞繁殖和分化 培养效果可用植板率来衡量 植板率 每个平板接种细胞总数中形成愈伤的百分率 即 每平板愈伤数 每平板接种的细胞总数 100 每平板接种的细胞总数 每ml培养液中细胞数 该平板细胞培养液ml数 四 原生质体融合 1 融合过程异种原生质体发生膜接触 形成细胞质桥 两种细胞质将两个核包围 完成融合 2 融合体类型对称杂种 综合双亲全部遗传物质的融合体非对称杂种 部分遗传物质发生丢失的融合体胞质杂种 双亲胞质 单亲细胞核非杂种 单亲的原生质体融合 3 融合方法原生质体不带电荷 它们相互排斥 需通过诱发才能发生融合 1 NaNO3处理 最早使用的融合诱发剂 融合频率低 对叶肉 高度液胞化 的原生质体有害 2 高Ca2 0 05MCaCl2 高pH 10 5 高温 37 C 处理 融合速度快 但频率不高 3 聚乙二醇 PEG 处理 25 50 PEG处理效果好 4 电融合 微电流 短时间电激 五 杂种细胞筛选与杂种鉴定 1 杂种细胞筛选p256形态互补法遗传