甘露聚糖酶研究进展.doc

-甘露聚糖酶研究进展时间:2010-09-16 11:53来源: 作者: 点击: 次 甘露聚糖是由-1，4-D-吡喃甘露糖连接而成的线状多聚体，是半纤维素的第二大组分，广泛存在于自然界中，它是多种植物细胞壁的主要组成成分。甘露聚糖在许多植物性饲料原料中含量很高，如豆粕中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖含量的22.7%、小麦为11.9%、菜籽粕为19.6%、麸皮为33.7。研究表明，甘露聚糖影响动物对营养物质的利用，是一种抗营养因子。-甘露聚糖酶是水解以-1，4-D-吡喃甘露糖为主链的甘露寡糖、甘露多糖(甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖)的内切水解酶，在饲料工业中作为一种绿色饲料添加剂，用于消除-甘露聚糖的抗营养作用。本文从-甘露聚糖酶的来源、提纯方法、酶学性质、作用机理及应用等方面，对-甘露聚糖酶做一简要介绍。1 -甘露聚糖酶的来源 -甘露聚糖酶在自然界中广泛存在，在动物(如海洋软体动物)、发芽植物的种子中(如长角豆、瓜豆、芦笋、番茄、胡萝卜等)和微生物中均有所发现，其中微生物是-甘露聚糖酶的主要来源。细菌、真菌和放线菌中均有多种是产-甘露聚糖酶的常见类群，如细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌，真菌中的曲霉、木霉、酵母、青霉、多孔菌、核盘菌，放线菌中的链霉菌等。对于合成-甘露聚糖酶的微生物研究较多的是枯草芽孢杆菌、曲霉菌、里氏木霉菌及链霉菌等。目前，应用于工业生产-甘露聚糖酶的菌种也多为芽孢杆菌、曲霉、酵母等。微生物来源的-甘露聚糖酶具有许多优点，如酶活性高、生产成本低、提取方便，具有pH、温度作用范围广以及底物专一性较高等特点。不论在工业生产还是理论研究中，微生物来源的-甘露聚糖酶均已得到了广泛应用。2 -甘露聚糖酶的分离纯化及酶学性质2.1 分离纯化 目前关于动、植物以及微生物中甘露聚糖酶的研究大多集中在对酶的分离、纯化、理化性质、对其降解产物的鉴定以及对应编码基因的克隆表达上。甘露聚糖酶的纯化对于进行详细的生化及分子生物学研究和测定其氨基酸序列及三维结构都是必需的。 甘露聚糖酶的纯化基于多种程序的组合，如超滤、硫酸铵沉淀、凝胶过滤、疏水相互作用以及离子交换层析等。对于纯化方法的选择往往是通过经验和实验室研究习惯进行的。从黑曲霉中纯化-甘露聚糖酶主要分为3个步骤：硫酸铵沉淀、亲和层析、离子交换层系和凝胶过滤层析。Stalbrand运用离子交换层析和亲和层析色谱聚焦从里氏木霉(Trichoderma reesei)中提纯得到了-甘露聚糖酶。嗜热杆菌 Thermotoga neapolitana 5068中稳定的-半乳糖苷酶和-甘露聚糖酶则是通过离子交换、疏水相互作用和凝胶过滤色谱等方法相结合获得的。从贻贝(贝壳类)消化道中分离的2种甘露聚糖酶是运用其亲和性、凝胶过滤和离子交换等方法相结合而获得的。用超滤和色谱从T4木霉菌株中可获得同质的胞外甘露聚糖酶。而提纯得到同质的-甘露聚糖酶，对于酶的分子生化方面的研究、氨基酸序列的测定以及三维结构的研究都是必要的。2.2 酶学性质 近年来，随着对自然界半纤维素资源的开发和饲料中甘露聚糖抗营养因子研究的深入，甘露聚糖酶的分子生物学的研究电逐渐展开。有关-甘露聚糖酶酶学性质研究的相关报道也很多，从这些报道中可以看出，从不同微生物提取液中提取的甘露聚糖酶的酶学性也各不相同。 韦跃华等从里氏木霉(T.reesei)基因组中克隆到一种-甘露聚糖酶基因，转化到毕赤酵母的基因组中，用甲醇诱导该基因表达后，摇瓶发酵结果表明，培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80，在pH5.06.0时酶活稳定，在pH5.4时70保温30min酶活维持50%以上。 谭秀华等还通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株，构建其基因组文库并从中克隆到一种-甘露聚糖酶基因，通过序列分析，该酶与GenBank发表的-甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%，是一种新型-甘露聚糖酶。构建该基因的毕赤酵母表达重组子，获得了该酶的诱导表达。对酶学性质进行分析，其最适反应温度为55，最适pH为7.5，以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U/mL，半衰期为1h。在80保温5min其酶活下降到11%，温度下降到55后活性可恢复到最初酶活的60%以上。 从几种微生物中提取的甘露聚糖酶的理化性质见表1（略），通过SDS-PAGE电泳和凝胶层析测定证明这些酶是以单体的形式存在。 总的来说，甘露聚糖酶的最适pH3.07.5、最适温度在4592之间。一种来自硫色曲霉的甘露聚糖酶的最适催化pH为2.4，在已知甘露聚糖酶中最低。通过在不同的温度下水浴10min到8h可知，各种甘露聚糖酶的耐热性也各不相同。它们中也有不同的动力学参数和等电点。3 -甘露聚糖酶的作用机理 -甘露聚糖酶是水解-1，4-D-吡哺甘露糖为主链的内切水解酶，作用底物主要是半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖以及甘露聚糖。不同来源的-甘露聚糖酶对不同来源的底物作用深度及其水解产物是不相同的。-甘露聚糖酶水解底物的方式和深度主要与-半乳糖残基和葡萄糖残基在主链中的位置、含量、酯酰化的程度有关。同时，底物的物理状态会影响争-甘露聚糖酶的水解作用，若底物呈结晶状态，则不易被水解。-甘露聚糖酶水解甘露聚糖后，将水解产物通过高效液相色谱(HPLC)或纸层析方法分析，可知水解产物主要是低聚糖(一般210个残基)，不同来源的酶和底物反应后，水解产物的聚合度大小也不相同。 存分解甘露聚糖过程中，由于甘露聚糖的结构，使得多种主、侧链酶在降解甘露聚糖时会产生协同作用。增效协同作用定义为2种主链酶(如-甘露聚糖酶和-甘露糖苷酶)或2种侧链酶(如-半乳糖苷酶和乙酰甘露聚糖酯酶)在作用于底物时的合作作用。如，在Sclerotium rolfsi中2种-甘露聚糖酶和-1甘露糖苷酶的协同作用使得降解半乳甘露聚糖产生的单体数量增多，提高了水解产物的总量。又如，T.neapolitana5068的耐热型-甘露聚糖酶、-甘露糖苷酶和-半乳糖昔酶协同水解半乳甘露聚糖为单糖。 目前在分子水平上，关于酶的分子特征和催化机制方面的研究报道还很少。吴襟等利用化学修饰的方法证明诺卡氏茼形放线菌产的-甘露糖酶中的巯基、酪氨酸残基及色氨酸残基是维持酶活性必需的基团。进一步研究征实，蛋白内部的二硫键是影响该酶热稳定性的重要因素Canm等从Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum中克隆到一种高分子量(119.6ku)甘露聚糖酶，缺失突变证明了该酶含有2个纤维素结合区和一个催化功能区。Chen等通过定点突变分析确认了硫色曲霉-甘露聚糖酶的催化位点为第206和314位的谷氨酸残基。4 -甘露聚糖酶的应用4.1 在动物生产中的应用 目前许多报道表明，在日粮中添加-甘露聚糖酶能提高动物的生产性能，具体表现为提高日增重、降低饲料增重比、提高动物机体免疫力等。在蛋鸡日粮中应用-甘露聚糖酶，能提高蛋鸡的产蛋性能，如提高产蛋量、增加平均蛋重。在断乳仔猪日粮中添加一定剂量的-甘露聚糖酶可以提高仔猪日增重，降低采食量和饲料增重比，显著降低断乳仔猪腹泻的发生。4.1.1 降低消化道内容物黏度，促进营养物质吸收 甘露聚糖具有高亲水性，在消化道内吸水后成凝胶状，妨碍了消化酶与食糜中营养物质接触，降低了消化酶的催化效率，同时减慢了食糜在消化道中的移动速度，影响营养物质的消化和吸收。-甘露聚糖酶能够分解甘露聚糖为寡糖，降低肠道内容物的黏度，利于消化酶和营养物质的有效接触，减少胆汁酸的排出，从而促进营养物质的消化和吸收。4.1.2 提高能量利用率，改善饲料转化率 由于甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，是构成植物细胞壁的主要成分，单胃动物不具备分泌相应酶的能力，使得被细胞壁包被的淀粉、蛋白质、脂类无法消化，影响饲料利用率。-甘露聚糖酶能够破碎细胞壁，释放出胞内养分，提高饲料的营养价值。如在肉仔鸡饲粮中添加-甘露聚糖酶可以降解日粮中-甘露聚糖纤维，增加肠道内消化酶的活性并释放营养物质，提高养分的表观消化率，同时消除-甘露聚糖的免疫应激作用，节约能量消耗，进而提高日粮氮校正表观代谢能水平，改善肉仔鸡生长性能。4.1.3 提高动物机体免疫力-甘露聚糖酶能分解甘露聚糖，降低肠道内容物的黏性。一方面这改善了肠道内葡萄糖的吸收，另一方面还能促进葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF-I)的分泌，从而促进畜禽的生长。-甘露聚糖酶分解甘露聚糖产生的甘露寡糖能够提高仔猪血液中IgG的含量，从而提高机体的免疫力。4.2 在工业中的应用 在纸浆漂白的酶处理工艺中，-甘露聚糖酶及其辅酶能够有选择性的分解部分甘露聚糖而不至于破坏纸浆中的纤维素。在加工速溶咖啡时，在咖啡豆提取物中添加-甘露聚糖酶，用于降解提取物中的半乳甘露聚糖，从而降低产品的黏度。5 结语-甘露聚糖酶能有效地降解饲粮中的甘露聚糖，提高饲料的消化率，提高动物