水稻群体分离中cry1Ab基因的遗传分析.doc

水稻分离群体中cry1Ab基因的遗传分析摘要: 含有cry1Ab基因的三种转Bt基因系（Tarom Molaii，Neda和Nemat）与常规稻品种杂交（crossed）。通过实地考察研究以及F2和BC1群体后代的PCR分析，对三种基因系二化螟抗性的状况进行调查。二化螟侵染的表型和分子水平上的cry1Ab和 RG100 引物聚合酶链反应分析得知，F2 和 BC1的分离群体的单基因分离率分别是3: 1 和 1: 1。在田间和实验室条件下， 1346和 243 个单独植物的表型及基因型分析获取的这些结果表示，cry1Ab 基因在籼型/籼稻遗传背景的后代中稳定遗传。因此，快速发展足够的抗虫性和理想农艺性状的转Bt基因水稻品种，可通过常规育种与分子标记辅助选择相结合来实现。引言水稻是最重要的粮食作物，世界人口的40%以其为主食。 90%以上的稻米的生产和消耗是在亚洲 (胡什和 Brar，2002年)。 2000 年全球人口超过6 亿，因此到2025年，一定要生产多于现在50%的粮食以满足日益增加的人口的需求。水稻生产效率受到几种非生物和生物应力的严重影响，包括害虫造成的损害。螟虫是在亚洲水稻生长环境中的慢性害虫。它们比任何其他组的水稻害虫会导致更多的产量损失(Savary et al.，2000年)，稻田中50%杀虫剂是针对鳞翅类的昆虫。使用化学物不只增加水稻生产成本但也导致水稻农民健康危害、非目标生物， 环境恶化。作物基因工程的研究进展开辟了具有新的遗传特性的转基因植物生产的新途径。 杀虫晶体是由转Bt基因产生的对鳞翅目，双翅目和鞘翅目昆虫具有高度毒性的蛋白质，已有几个转基因水稻植株的昆虫物种的有效控制的成功报道。(Ghareyazie et al., 1997; Shu et al., 2000; Tu etal., 2000; Ye et al., 2003; Ramesh et al., 2004; Bashir etal., 2005). 这种转 bt 基因水稻植株意味着对害虫综合的管理 （IPM） 程序作出了重要贡献的一种有前途的机会(Mohan et al., 2003)。转基因作物的稳定遗传和转基因的表达对传统育种方案中基因工程的成功应用具有重要作用(Wu et al., 2002)。含有土壤细菌苏云金芽孢杆菌 (Bt)基因的水稻的转化是常用方法。这种方法为植物育种家利用其他物种基因提高对昆虫的抗性提供一个机会。一旦一个基因稳定导入水稻植株，它可以通过经典育种的程序被利用于新品种的发展，特别是在现代的技术并不总是可用的发展中国家(Wang et al., 2002).。外源基因的遗传和稳定表达已在不同转基因植株中被广泛研究，其中包括水稻。Gahakwa et al. (2000) 研究了不同遗传背景下，多种标记和杀虫转基因的遗传和表达。他们对孟德尔方式中三代的所有转基因传递的真实反映，表明了cry1Ab基因在转基因株系中以单显性位点整合。王（2002 年）和吴 et al.等人 （2002 年）的研究，显示出粳稻/粳稻杂交cry1Ab 基因的分离符合孟德尔 3： 1 的比率。籼粳稻米杂交中表现出扭曲的分离。最近研究中对转 bt 基因水稻株的 cry1Ab 基因的分离模式分别在田间条件下以及在分子水平进行讨论。这类转基因和非转基因植物之间杂交后cry1Ab 基因的遗传研究对害虫综合治理和 cry1Ab 基因在水稻中的可持续利用很重要。材料和方法植物材料和杂交方法在此研究中使用的遗传材料载于表 1。在2006年种植季节，携带cry1Ab基因的转基因株系与非转基因品种之间进行了杂交，利用转基因株系做父本。此外，原有的DN - 33 18系和DN - 32 6与转基因的Neda之间的杂交也同时进行。授粉的穗使用正确袋装。由此产生的F1代种子用同样的方式种植在明年（2007）获得F2代种子。DN-33-18/Neda-Bt以及DN-32-6/Neda-Bt杂交的F1代与各自轮回亲本回交获得BC1代后代。采用传统田间管理方式，但是在整个实验过程中没有农药应用。氮磷钾化肥使用量分别是250、 100、 50Kg /ha。实地抗性评估在营养与籽粒灌浆阶段，对F2 和 BC1 后代个体抗性进行评价，以植物坏心和白头作为对二化螟敏感性的症状进行识别(Ghareyazie et al., 1997).。对整个种群中每个植株由SSB引起的坏心和白头现象做好记录。为了确定SSB引起的坏心和白头的症状，解剖坏心和白头的茎的分蘖处观察由于SSB伤害导致的幼虫或者害虫经过的痕迹(Shu et al.,2000).。PCR分析水稻叶片中DNA按照Dellaporta et al. (1983).描述的方法提取。PCR分析以cry1Ab 和 RG100 引物按照Ghareyazie et al. (1997完成。PCR反应用25l 混合物体系进行检测，包含50 ng模板DNA，2.5 l of 10X buffer, 0.3 l of 10 mM dNTPs, 1 l of50 mM MgCl2, 两个引物各1 l, 1 unit Taq酶。PCR 反应程序是 94 5 分钟（初始变性)；然后 94 40 个循环1 分钟， 55 1 分钟， 72 3 分钟最后72 5 分钟。RG100引物位点为5-GCT GGA CGT GCC AAA GAG AG-3(向前) and 5-CGA ACC ACA GCC ACA GCA TG-3 (相反)， 预期的PCR产物大小为0.95 Kb。cry1Ab基因的引物为5-GGC GGC GAG AGG ATC GAG AC-3向前) 和5-TCG GCG GGA CGT TGT TGT TC-3（反向）预期的PCR产物大小为1.2 Kb (Ghareyazie etal., 1997).。然后由TAE为缓冲液的1.5琼脂糖凝胶电泳缓中，对PCR产物进行分析。对拟合程度即预想的孟德尔3:1或1：1的比率的分析，用卡方检测进行分析。结果田间条件下，SSB 自然侵袭后的表型评估的结果，载于表2。通过识别坏心和白头植株来评估不同群体中的单个植株对SSB侵袭的反应。除了芳香*芳香外的所有杂交组合，易受感染植物的抗性的分离模式，和预期的3:1差异不显著。这就说明了，对SSB的抗性是受一个单独的显性基因控制的。BC1后代的评估结果是1:1,这个结果也支持转基因株系中抗SSB是受单个位点的控制的（表2）。基于PCR的方法用来跟踪所有群体中转基因的遗传，包括芳香芳香，芳香非芳香，非芳香非芳香（表3）。用RG100和cry1Ab基因引物进行的PCR分析结果明确确认了在所有的杂交类型包括芳香芳香，中cry1Ab基因单基因分离的模式（图1），这显然背离了预期在田间试验表型检测的比例3:1。这些结果显示不同遗传背景并不会影响籼型水稻与籼型杂交中 cry1Ab 基因的遗传模式。讨论当外源基因插入到宿主基因组时往往会导致自交 (Nayak et al., 1997; Cheng et al., 1998; Datta et al.,1998; Chen et al., 2005; Ho et al., 2006)或F2群体(Wang et al., 2002)按预期3:1和回交后代1:1(Peng et al., 1992; Hiei at al., 1994; Nayak et al.,1997; Wang et al., 2002).的分离比例。在特殊情况下，在转基因植物中的基因分离，可偏离孟德尔的预期比例(Datta et al., 1990; Goto et al., 1993; Peng et al., 1995; Husnain etal., 2002).。转基因花粉低活力和低受精能力(Wu et al., 2002)，跨物种杂交的低生育率(Wang et al., 2002)，转基因沉默(Kohli et al., 1999)和配子选择(Lyttle, 1991)可能是这一现象的原因。在这项实验中，观察到F2 和 BC1 群体和预期的 3: 1 或 1： 1没有偏差。聚合酶链反应分析也明确支持这结论。但是，仅在芳香芳香杂交中;明显观察到在田间条件下的单基因分离偏离。上述机制没有一个可以解释这个现象。虽然如此，PCR分析结果清楚地表明：在所有杂交类型中的单基因分离规律和观察到的偏差，这有可能是在田间条件下敏感性植物的表型评估错误，也可能是由粮食灌浆期转基因Tarom Molaii抗性下降导致(Alinia et al., 2000)。结合在不同群体中从 1346和243 个独立植物的田间和聚合酶链反应分析获得数据，结果显示，三种转基因 Tarom Molaii、 Neda 和 Nemat 株系暗示了，转基因植物中转基因的遗传和可忽略基因沉默这种可预测模式的理想特点(Finnegan and McElroy,1994).在提高抗虫性的常规育种中，理想的基因型与抗源之间杂交衍生的分离群体，受到天然或人工的害虫或疾病攻击。虽然这些程序可以给出优异的结果，但是他们既耗时又昂贵。使用 PCR 引物设计来扩增 cry1Ab 基因有助于标识携带该基因的植物而避免他们早代遭受昆虫袭击。这种方法只需要用单株少量的DNA 来检测而不摧毁植株。而且可使育种工作者在一年内进行多轮分子筛选而不依靠关于自然发生或害虫的存在。在不同的F2群体中，根据其重要农艺性状，选择优良单株，如早熟，株高，穗长等，