草地螟触角普通气味结合蛋白基因的克隆及序列分析[1].pdf

收稿日期 2008201218 修订日期 2008203217 基金项目 国家科技支撑计划 2005BA529A03 2005BA529A04 3 通讯作者E2mail redliuhuai E2mail yzcao 草地螟触角普通气味结合蛋白基因的 克隆及序列分析 钟 涛1 2 尹 姣2 刘 怀1 3 王进军1 李克斌2 韦永贵2 曹雅忠2 3 1 西南大学植物保护学院 重庆 400716 2 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室 北京 100193 摘要 利用RT2PCR结合RACE技术克隆了编码草地螟 Loxostege sticticalis 触角中一种普通气味结合蛋白的基 因 序列分析表明 成熟蛋白的序列中含有阅读框序列 推导的氨基酸序列与已报道的11种鳞翅目昆虫普通气味 结合蛋白 比较 平均相似度在62 3 左右 并拥有气味结合蛋白的典型结构特征 该基因归属于普通气味结合 蛋白 基因亚族 因此将它命名为LstiGOB P1 关键词 草地螟 触角 普通气味结合蛋白 RT2PCR RACE 中图分类号 Q 785 S 433 4 Cloning and sequence analysis of one general odorant binding protein gene from the meadow moth Loxostege sticticalis Linnaeus Zhong Tao1 2 Yin Jiao2 Liu Huai1 Wang Jinjun1 Li Kebin2 Wei Yonggui2 Cao Yazhong2 1 College ofPlant Protection Southwest University Chongqing 400716 China 2 State Key L aboratory f or Biology ofPlant Diseases and Insect Pests Institute of Plant Protection CAA S Beijing 100193 China Abstract In this paper techniques of reverse transcription polymerase chain reaction RT2PCR and rapid amplifi2 cation of cDNA ends RACE have been used to clone a gene which encodes a general odorant binding protein from the antennae ofLoxostege sticticalis Sequence analysis showed that the predicted mature protein of the cDNA se2 quence had an open reading frame ORF and the deduced amino acid sequence showed an average identity of 62 3 with the reported sequences of GOBP1 from eleven other Lepidoptera insects and shared the typical structural features of odorant binding proteins from other insects This gene belongs to a general odorant binding protein gene subfamily Accordingly authors named it asLstiGOB P1 Key words Loxostege sticticalis antennae general odorant binding protein RT2PCR RACE 草地螟 L oxostege sticticalis Linnaeus 又名 网锥额野螟 甜菜网螟 属鳞翅目 螟蛾科 野螟亚 科 锥额野螟属 是我国东北 华北和西北地区发生 的多食性害虫之一 取食为害大豆 苜蓿和甜菜等作 物 具有远距离迁飞为害和周期性暴发特性 严重威 胁了我国北方的农牧业生产 1 草地螟对寄主植物具有明显的选择取食 产卵 为害的特性 2 其中 嗅觉识别又是蛾类感知寄主植 物信息的重要方式 灵敏的嗅觉在草地螟搜寻合适 的寄主植物及选择产卵地的过程中发挥着重要作 用 而触角作为昆虫最主要的嗅觉感受器官 能够依 靠化学物质进行信息的传递 从而在数万种化合物 分子中识别出它所需要的气味分子 3 已有研究证 实 在鳞翅目 双翅目 鞘翅目和膜翅目等全变态昆 虫中都发现了气味结合蛋白 OBPs 的存在 这种蛋 白能结合疏水性气味化合物 并携带它们快捷地穿 过水溶性的淋巴液 实现气味在触角表皮与嗅觉神 经元上的膜结合受体之间传递 4 目前 对草地螟与寄主植物之间的化学通讯研究 比较缺乏 仅在草地螟对寄主植物的选择性及寄主植 物的挥发物质行为反应等方面进行了研究 1 因此 开展草地螟感知 识别寄主的分子机理方面的研究不 13 研 究 报 告 第34卷第4期 2008 PLANT PROTECTION Vol 34 No 4 2008 仅能够揭示其选择寄主植物的分子机制 而且还可以 为进一步了解草地螟与寄主植物之间的化学信息联 系 阐明草地螟选择寄主产卵与取食的内因提供可靠 的理论依据 同时为研制 开发防控草地螟的药剂提 供新思路 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 供试昆虫 草地螟幼虫用野生灰菜饲养 成虫羽化后3 d 内分别剪下雌 雄触角 立即放在液氮中速冻 然后 70 保存 1 1 2 菌种及质粒 p GEM2T Easy载体购自Promega公司 感受 态大肠杆菌DH5 购自北京博大泰克公司 1 1 3 主要试剂及工具酶 Ex Taq DNA聚合酶 限制性内切酶EcoR 琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒 3 2Full RACE Core Set购自TaKaRa公司 Ampicillin X2gal IPTG购 自北京博大泰克公司 总RNA提取试剂盒 cDNA 第1链合成试剂盒等购自QIAGEN公司 质粒小量 快速抽提试剂盒及DNA Marker DL4000和D50 购自北京明日百傲公司 其他试剂均为国产或进口 分析纯试剂 1 2 方法 1 2 1 触角总RNA的提取及cDNA第1链合成 将保存的草地螟雌 雄成虫触角各取20 mg 加 液氮捣碎组织后 使用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取总RNA 经NanoDrop核酸浓度仪测 定含量后 使用cDNA第1链合成试剂盒合成cD2 NA第1链 1 2 2 引物设计 根据GenBank中已登录的其他蛾类昆虫的 GOBP1基因序列 家蚕 Bomby x mori 黄地老虎 A grotis segetum 小地老虎 A ipsilon 棉铃虫 Helicoverpa armigera 烟芽夜蛾 Heliothis vi2 rescens 斜纹夜蛾 S podoptera litura 中国柞蚕 A ntheraea pernyi 烟草天蛾 Manduca sexta 烟 实夜蛾 Helicoverpa assulta 的GenBank登录号分 别 为NM 001044031 DQ838577 DQ838578 A Y049739 X96862 EF159978 Y10970 M73797 A Y864774 设计并合成引物 正向引物 gps4 5 GTBATGAARGA YGTCACBCTNGG 3 反向引 物 gpa4 5 AGGTTRAAGTGBCKGCTCAT 3 上海生工生物工程技术服务有限公司合成 1 2 3 PCR扩增 以合成的cDNA第1链为模板 反应体系为cD2 NA 2 L 10 Ex Taq Buffer 2 5 L dNTP2 L 各 2 5 mmol L TaKaRa Ex T aq 5U L 0 25 L 正 反引物各1 L 10 mol L 加灭菌水至25 L 混匀 离心 然后放入PCR仪 Eppendorf Mastercycler Gra2 dient 扩增 反应条件为94 变性3 min 接着35个 循环 循环条件为94 45 s 56 6 45 s 72 1 min 最后72 延伸5 min 扩增完毕后 用2 的 琼脂糖凝胶电泳鉴定 纯化 并回收目的片段 1 2 4 PCR产物的克隆和鉴定 利用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收PCR产 物 将纯化得到的DNA连接到p GEM2T Easy载 体 再转化到感受态大肠杆菌DH5 中 然后涂布在 含有Ampicillin X2gal IPTG的LB平板上 37 培 养16 h 待长出蓝 白斑后 随机挑取白斑 培养后 采用质粒小量快速抽提试剂盒提取质粒 利用菌落 PCR和EcoR 酶切的方法 鉴定重组克隆pGEM LstiGOB P1 1 2 5 序列测定和分析 DNA的序列测定在北京奥莱博生物科技有限 责任公司进行 1 2 6 RACE扩增 以RT2PCR得到的目的DNA序列 按照试剂 盒的要求设计引物 并参照说明书扩增该基因的 cDNA的3 末端序列 目的DNA片段的上游特异 性引物 3R 2go1 5 GACGGA GGAGTTCTTC2 CACTTCTG 3 上海生工生物工程技术服务有限 公司合成 试剂盒中的下游接头引物 3sites Adap2 torPrimer 5 CTGA TCTAGA GGTACCG2 GATCC 3 1 2 7 RACE产物的克隆和鉴定 方法参照1 2 4 PCR产物的克隆和鉴定 1 2 8 序列测定和分析 DNA的序列测定在北京奥莱博生物科技有限 责任公司进行 2 结果与分析 2 1 GOBP1基因的扩增和克隆 以草地螟触角cDNA为模板扩增的DNA产 物 分别进行琼脂糖凝胶电泳分析 结果见图1 图 2 从中可以明显看出 PCR及3 RACE扩增的产 物长度分别达到170 bp和500 bp左右 图1a 图 2a 并且它们分别经EcoR 酶切后得到的条带与 设计相符 图1b 图 2b 23 第34卷第4期 2008 PLANT PROTECTION Vol 34 No 4 2008 研 究 报 告 图1 LstiGOBP1基因PCR产物经2 的 琼脂糖凝胶电泳 图2 G OBP1基因3 全末端RACE扩增 产物经2 的琼脂糖凝胶电泳 2 2 序列测定和分析 草地螟GOBP1基因的核苷酸序列如图3所示 推 导的氨基酸序列位于核苷酸序列之下 方框内为保守 的半胱氨酸位点 该基因已在GenBank中登录 登录 号为EU413989 序列测定和结果分析表明 已获得草地螟GOBP1 基因开放阅读框为423 bp 编码142个氨基酸残基 预 测的分子量为16 1ku 等电点为5 00 该蛋白拥有气 味结合蛋白的共同特征 序列中含有6个保守的半胱氨 酸位点 呈酸性 且雌雄虫GOBP1的核苷酸序列相同 图3 草地螟GOBP1基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列 利用DNASIS软件 根据Robson的方法对编 码GOBP12Lsti的mRNA进行了二级结构预测 结 果表明该基因的二级结构主要为 2螺旋 此外 采 用Kyte和Doolittle等的方法对GOBP12Lsti氨基 酸序列进行亲脂性分析 5 表明该蛋白中包含3个 亲脂性区域 图 4 这些区域很可能是亲脂性气味 物质的结合位点 图4 草地螟GOBP1氨基酸亲脂性分析 33 研 究 报 告 第34卷第4期 2008 PLANT PROTECTION Vol 34 No 4 2008 利用NCBI BLAST network server在Gen2 Bank EMBL中进同源性搜索发现 在GenBank EMBL中登录的有完整序列的昆虫GOBP1基因共 11种 基于序列的同源性比较发现 表1 昆虫 GOBP1氨基酸序列具有明显的同源性 平均相似度 在62 3 左右 表1 12种蛾类G OBP1氨基酸序列同源性比较 LstiPxylSlitAipsAsegAperBmorHarmHassHvirMsexEpos GOBP1Lsti100 0 GOBP1Pxyl60 3100 0 GOBP1Slit64 576 9100 0 GOBP1Aips63 876 689 0100 0 GOBP1Aseg64 577 190 396 6100 0 GOBP1Aper65 274 472 676 776 6100 0 GOBP1Bmor65 266 770 076 777 273 6100 0 GOBP1Harm63 174 187 887 787 677 775 0100 0 GOBP1Hass65 275 287 086 386 980 177 494 5100 0 GOBP1Hvir63 873 187 288 489 773 871 393 291 8100 0 GOBP1Msex66 070 574 877 277 875 974 777 679 373 6100 0 GOBP1Epos43 938 337 939 939 436 636 938 638 536 037 8100 0 通常物种间的亲缘越近 GOBP1的核苷酸和氨 基酸序列的同源性也会越高 从LstiGOBP1与其 他11种已知蛾类的进化树 图 5 可以看出 草地螟 与它们在进化水平上相隔很远 因此 相对其他11 种蛾类来说 草地螟与它们的亲缘较远 Lsti Loxostege sticticalis 登录号ACB47481 Msex Manduca sexta 登录号P31418 Pxyl Plutella xylostella 登录号ABW05104 Slit S podoptera litura 登录号ABM54823 Aips A grotis ipsilon 登录号ABI24160 Aseg A grotis segetum 登录号ABI24159 Harm Helicoverpa armigera 登录号AAL09821 Hvir Heliothis virescens 登录号Q27226 Hass Helicoverpa assulta 登录号AAW65076 A per Antheraea pernyi 登录号P87508 Bmor Bombyx mori 登录号NP 001037496 Epos Epiphyas postvittana 登录号Q95VP3 图5 草地螟与其他已知蛾类G OBP1 氨基酸序列的进化树比较 3 讨论 本试验利用RT2PCR结合RACE技术从草地 螟触角RNA中克隆了编码草地螟GOBP1的基因 根据测序结果推导的氨基酸序列具有气味结合蛋白 的典型特征 属于GOBP1蛋白亚族 并依据惯例将 它命名为LstiGOB P1 鳞翅目昆虫触角中的普通气味结合蛋白 GOB2 Ps 的基因序列高度同源 氨基酸和核苷酸序列都非 常保守 在LstiGOBP1蛋白序列中包含7个半胱氨 酸位点 其中6个半胱氨酸的空间分布在不同的物种 间始终恒定 6 图 6 半胱氨酸普遍遵循着这样一个 规 则 X182Cys2X302Cys2X32Cys2X422Cys2X82102Cys2X82 Cys2X24226 其中X代表任意氨基酸 7 而这6个保守 的半胱氨酸在LstiGOBP1的空间分布恰好符合X152 Cys2X302Cys2X32Cys2X422Cys2X102Cys2X82Cys2X27 很 显然 LstiGOBP1的N末端还不十分完整 在对草地螟普通气味结合蛋白家族的两个成员 GOBP1和 GOBP2 的分析中 另文发表 发现 GOBP1基因并没有GOBP2基因那样在分科水平上 高度保守 而是呈现出离散的特点 例如97 100 117 122氨基酸之间具有明显的差异 这可能反映 了LstiGOBP1在进化中的变异与功能的分化 Krieger提出气味结合蛋白的种类在昆虫触角中是 极其庞大的观点 7 而Vogt也认为OBPs的种类和 变异恰好反映了昆虫间化感行为的多样性 4 可以通过二硫键的联结信息来了解翻译后的蛋 白修饰情况 经SCRATCH预测LstiGOBP1的蛋 白序列 二硫键的发生位点分别在Cys16 Cys51 Cys105 Cys119和Cys94 Cys114 而Leal在对 43 第34卷第4期 2008 PLANT PROTECTION Vol 34 No 4 2008 研 究 报 告 家蚕信息素结合蛋白基因的二硫键结构的研究中发 现 该蛋白中存在3个二硫键 分别位于Cys19 Cys54 Cys50 Cys108和Cys97 Cys117 8 考虑 到LstiGOBP1蛋白序列还不完整 所以与Leal的 研究结果是一致的 但仅仅在第2个二硫键的构成 上有所不同 在LstiGOBP1蛋白序列中 由第5 Cys105 与第7 Cys119 共同形成了二硫键 这种 差异很可能决定了GOBP1结合气味因子的形状和 种类 此外 在多数已研究的蛾类中 都存在着第7 个半胱氨酸 而且它的位点也是十分保守的 图 6 图6 昆虫G OBP1氨基酸序列同源性比较 GOBPs的三维结构目前还不十分清楚 但是其 疏水和亲水结构域在载体蛋白中的特性分布非常重 要 Krieger预测的疏水结构域通常在第40 60个 氨基酸之间 这可能是用来结合气味化合物的区 域 9 Steinbrecht的研究小组证实GOBPs在触角 中是专一表达的 分布在含有特殊识别功能的受体 细胞的感觉器中 它们只对食物和寄主气味有特殊 反应 但不包括信息素分子 10211 Feng也证实 GOBP1具有更广泛地结合绿色植物和有花植物的 气味分子的功能 12 LstiGOBP1同样包含了交替 变化的疏水和亲水结构域 这种结构决定了其结合 气味分子并运送的功能 通常GOBP1成熟蛋白包含144 146个氨基 酸 而氨基酸数目的恒定也维持GOBP1蛋白的功 能稳定 7 N末端亲水性区域通常有18 26个氨 基酸 该肽段揭示了信号肽的性能特征信息 13 目 前 在LstiGOBP1序列中还未包含完整的N末端信 息 5 RACE试验正在开展之中 参考文献 1 尹 姣 曹雅忠 罗礼智 等 草地螟对寄主植物的选择性及其化 学生态机制 J 生态学报 2005 25 184421852 2 尹 姣 曹雅忠 罗礼智 等 寄主植物对草地螟种群增长的影响 J 植物保护学报 2004 31 1732178 53 研 究 报 告 第34卷第4期 2008 PLANT PROTECTION Vol 34 No 4 2008 3 Zubkov S Gronenborn A M Byeon I J Structural conse2 quences of the p H2induced conformational switch inA poly2 phemuspheromone2binding protein mechanisms of ligand re2 lease J J Mol Biol 2005 354 108121090 4 Vogt R G Callahan F E Rogers M E et al Odorant binding protein diversity and distribution among the insect orders as indicated by LAP an OBP2related protein of the true bugL y2 gus lineolaris Hemiptera Heteroptera J Chem Senses 1999 24 4812495 5 Kyte J Doolittle R F A simple method for displaying the hy2 dropathic character of a protein J Journal of Molecular Biolo2 gy 1982 157 1052132 6 Raming K Krieger J Breer H Primary structure of a phero2 mone binding protein fromAntheraea pernyi homologies with other ligand carrying proteins J J Comp Physiol B 1990 160 5032509 7 Krieger J Nickisch2Rosenegk E V Mameli M et al Binding proteins from the antennae ofBombyx mori J Insect Bio2 chem Molec Biol 1996 26 2972307 8 Leal W S Nikonova L Peng G H Disulfide structure of the pheromone binding protein from the silkworm moth Bombyx mori J FEBS Letters 1999 464 85290 9 Krieger J G n le H Breer H Odorant binding proteins of Heliothis virescens J Insect Biochem Molec Biol 1993 23 4492456 10 Laue M Steinbrecht R A Zigelberger G Immunocytochemi2 cal localization of general odorant2binding protein in olfactory sensilla of the silkmothAnf heraea polyphemus J Naturwis2 senschaften 1994 81 1782180 11 Steinbrecht R A Laue M Ziegelberger G Immunolocalization of pheromone2binding protein and general odorant2binding pro2 tein in olfactory sensilla of the silk mothsAntheraea and Bom2 byx J Cell Tissue Res 1995 282 2032217 12 Feng L Prestwich G D Expression and characterization of a Lepidopteran general odorant binding protein J Insect Bio2 chem Molec Biol 1997 27 4052412 13 Von Heijne G A new method for predicting signal sequence cleavage sites J Nucl Acids Res 1986 11 468324690 收稿日期 2007211207 修订日期 2007204203 基金项目 国家 863 计划资助项目 2004AA247010 3 通讯作者 蛇床子提取物对黄瓜枯萎病菌抑制效果的研究 马丽娟 周宝利 3 张淑红 付亚文 沈阳农业大学园艺学院 沈阳 110161 摘要 从蛇床子中提取抑制黄瓜枯萎菌的活性成分 正交优选提取条件 并在不同浓度下测定其抑制效果 结果表 明 在室温下 95 乙醇连续超声提取3次 每次45 min为宜 当提取物浓度为10 mg mL时 菌丝生长抑制率达 78 65 浓度大于100 mg L时 孢子萌发抑制率为100 浓度为8 mg mL时 相对防效为40 95 关键词 黄瓜 枯萎病菌 植物提取物 蛇床子 抑菌活性 中图分类号 S 436 421 Inhibitory