Sybr Green法的实验策略.doc

Sybr Green法的实验策略：实验可分为三个阶段，即实验条件的优化、预实验和正式实验。一、 实验条件的优化阶段，这一阶段是最花时间的，1、 要找到一个阳性的模板，可以是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR产物等。有了阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验，如果有普通PCR的实验条件，也可以此为基础进行实验。2、 扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小，以确认定量PCR扩增的产物是你的目的基因，有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对，不是自己想要的基因。当然，能测个序什么的最好。并通过融解曲线实验来确定产生的Tm值以及所用的变性温度是否已经足够，个别情况下会出来解键不充分的现象。3、 有了基本的PCR条件后，要将阳性模板进行倍比稀释，一般用10倍稀释。将稀释的模板带上阴性对照，分成多份进行温度梯度实验，对复性温度进行优化，以找出复性温度范围，复性温度最好能满足以下条件：高中低模板浓度下PCR扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。选择满足条件的中间温度，这样可以提高实验的稳定性，不会因为样本管在加热模块中的位置不同而影响实验结果。4、 如果找不到合适的条件，如引物二聚体过多，可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化，然后再进行复性温度梯度实验。其中Mg2+离子浓度、DMSO含量都会影响Tm值以及所用的变性温度。二、 预实验阶段按照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验，每个样本做一个10倍和100倍稀释的实验，预实验的目的主要有两个，一是了解样本的模板浓度范围，如果有样本的模板浓度在标准曲线之外，如过高或过低，则可能要对标准曲线进行重新优化，当然，如果过高和过低不影响你的实验结论则可定为高于多少或低于多少，直接进行外推是不科学的。另一个目的看样本中是否有PCR抑制物的影响，如果每个样本的定量结果与其10及100倍稀释后的样本的结果相同，则表明没有抑制物的影响，如果不同，如原倍结果为零，而10及100倍稀释后的样本的结果为阳性，则表明样本中PCR抑制物浓度较高。可用其10及100倍稀释后的样本进行定量。有几个用户发现过实验为阴性的样本在其10及100倍稀释后的样本为阳性的，也许有更多用户没有进行这样的实验，得到了错误的结论。因为样本RNA的提取试剂中经常有抑制PCR反应的物质，清洗不干净就会影响到定量PCR反应。三、 正式实验阶段然后就可以进行正式实验了，只需要将每个样本作三个或更多的重复即可以了。有抑制物的样本先进行稀释，计算浓度时不要忘记就行了。最后就可以进行实验结果分析了，个别样本中离群的数值可以删除。Sybr Green法的注意事项1、 最好按照上面提到策略进行实验，以免造成不必要重复实验，从而降低实验成本2、 Sybr Green I一般是先将母液用DMSO进行稀释100倍，最终的使用浓度为4000-10000分之一。可能不同的Sybr Green I母液的稀释倍数不同，可通过实验来证明，但高浓度的Sybr Green I肯定会影响PCR反应。另外用水稀释后的Sybr Green I保存的时间很短，一般1周后就不能用了。DMSO似乎反复冻融会影响性能，但原因不明。3、 在对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化后仍得不到满意的结果，特别是引物二聚体很多时，可以考虑更换引物，因为引物成本低，而优化实验成本很高。4、 当有少量引物二聚体影响荧光结果时，可以提高荧光读板时的温度来消除引物二聚体的影响，如将读板时的温度提高到82度，此时引物二聚体已经解链而产物没有解链。但引物二聚体浓度很高时会严重影响PCR反应，消除引物二聚体的影响也没有用。5、 大家都知道进行绝对定量需要标准曲线，有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了，可以通过2C（t）来计算，但这一计算是有条件的，即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2C（t）来计算了。这是错误的，会得到错误结论。6、 无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒，最好买够试剂，以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂，由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别，如有的试剂中含有DMSO及Mg2+离子等，可能会影响到实验结果，甚至要重新进行实验条件的优化。7、 不要在管盖上写字，原因很明显，但有些用户习惯了写字，后来再擦掉，也会对实验有些影响。8、 最好使用高质量的PCR管，低质量管的管间差可能会很大。9、 每次实验一定要有阳性对照和阴性对照，以免出现问题时找不到原因。10、 在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量。只要浓度不是太低，理论来讲对稀释是不会影响实验结果的。其他方法也可以采用类拟的策略，以节约成本，提高效率。想到的内容就这些了，希望大家多批评指正。反应体系的建立及优化 来源： 作者： 发布时间：2008-10-17 1. SG浓度：终浓度1:5,0001:100,000，一般为1:10,0001:70,0002. Primer浓度：终浓度50nM300nM固定摸板浓度的梯度实验不加摸板的对照实验（NTC）有无非特异信号熔解曲线的分析是否单峰建议使用HPLC纯化的引物3. MgCl2浓度降低MgCl2浓度以减少非特异性产物最低可至1.5nM同时做梯度实验和NTC对照4. 反应温度和时间参数反应温度参考所用酶的种类退火温度使用温度梯度功能优化反应时间与常规PCR类似，扩增片断一般为200300bp5. TaqMan探针引物、探针设计：首先选择探针序列探针的Tm值为6870度，长度不应超过30碱基探针的5端不应是G，G有可能会淬灭荧光素引物应尽量靠近探针，扩增片断不超过400bp，通常为80150bp引物的Tm值为5960度，长度约20碱基避免引物、探针之间的二级结构委托合成公司设计使用辅助软件确定反应参数一般为两步法，94