产前地塞米松对孕鼠和早产胎鼠IGF-I的影响.doc

产前地塞米松对孕鼠和早产胎鼠IGF-的影响陈贵岭1 成要平2* (1山西医科大学第二医院医院妇产科 030001；2*山西医科大学第一临床医学院妇产科 030009，通讯作者)【摘要】 目的：地塞米松在促进早产胎鼠肺脏成熟的同时对孕鼠和早产胎鼠IGF-I的影响。方法：18只孕鼠随机分为对照组（CT组），地塞米松单剂量组（SD-DEX），地塞米松多剂量（MD-DEX），在孕鼠怀孕14、15天给予不同剂量的地塞米松,在孕鼠怀孕16.5天行剖宫产终止妊娠，电镜下观察胎鼠肺脏成熟度，放射免疫法测定孕鼠血清、胎鼠羊水中IGF-I的含量，进行同组间的相关性分析；免疫组化法进行胎鼠肝脏和胎盘中IGF-I的表达，进行同组间胎鼠肝脏与胎盘中IGF-的相关性分析。结果：产前地塞米松应用在促进早产胎鼠肺脏成熟的同时可以导致孕鼠血清中IGF-含量明显下降，这与用药后孕鼠体重下降有相关性。孕鼠血清中IGF-I和胎鼠羊水中IGF-I没有相关性。结论：地塞米松在促进早产胎鼠肺成熟的同时影响了孕鼠血清和胎鼠羊水中IGF-含量，影响孕鼠体重变化和胎鼠的生长发育。关键词：地塞米松，生长和胚胎发育，胰岛素样生长因子I，大鼠，早产Effect of dexamethasone on pregnant and preterm birth of fetal rat with IGF-ICHEN Guiling1 CHENG YaoPing2 (1Second Clinical Medical college,Shanxi Medical University 030001；2Frist Clinical Medical College,Shanxi Medical University,030009；*CorresPonding author,TelE-mail:)Abstract Objective To explore the of dose of dexamethasone administered antenatally on lung morphogenesis of rat embroy and correlation with insulin-like growth factor-I(IGF-I) of pregnant rat and fetal amniotic.Methods Eighteen pregnant rats were randomly assigned to three group with 6 in each,control,single dose detamethasone (SD-DEM),multilate dose dexamethasone (MD-DEM).It injected dexamethasone of different dose on the 14th,15th.All fetuses were delivered by cesarean delivery on the 16.5th.The lung mature and growth of fetal mice were compared at morphometric.The IGF-I of serum pregnant rat and fetal amniotic were measured by radioimmunoassay and analysised the correlation between the same group.The IGF-I of fetal rat liver and placental were measured by immunohistochemistry and analysised the correlation between the same group.Results It is leaded to lower of serum pregnant with IGF-I that injected dexamethasone before cesarean,there was correlation between weight of pregnant rat and IGF-I of serum pregnant.there was no correlation between IGF-I of serum pregnant and the amniotic fluid IGF-I of fetal rat. Conclusions Antenatal treatment with dexamethasone may improve lung growth and influence IGF-I in serum of pregnant rats and amniotic fluid of fetal rat .The growth of fetal rat and weight of pregnant could be influenced through affecting IGF-I.Keywords Dexamethasone;Growth and embryonic development; Insulin-like growth factor- I,Rats,Preterm birth 早产是导致围生期新生儿死亡的主要原因1。危及早产儿生命的急性病当属新生儿呼吸窘迫综合症（RDS）。1969年，Liggins发现产前皮质类固醇（ACT）有促胎羊肺成熟的作用2。30余年来，ACT在大量的动物实验及临床研究中应用，并证实ACT的最佳作用时间是分娩前7天至分娩前24小时3。对于用药后7天仍未分娩且有持续早产先兆的孕妇重复应用对母儿的潜在影响已引起广泛的重视，重复应用后对仔代肺脏成熟有益。重复用药后对胰岛素样生长因子-I（IGF-I）的影响目前未见报道。IGF-属胰岛素样生长因子系统家族中的一员，是一类能够刺激糖原、脂质、蛋白质合成及碳水化合物代谢，抑制脂肪降解，促进细胞增殖和分化的单肽。人类孕中期胎儿组织如肾脏、肺、肠、肝脏、肾上腺皮质、骨骼、心脏、平滑肌、造血组织和皮肤中均可检测出IGF-。本实验建立孕鼠早产模型，比较不同剂量的地塞米松在促进早产胎鼠肺脏成熟的同时对孕鼠血清和胎鼠羊水中IGF-I含量的影响。1、材料与方法1、1 材料、主要实验仪器、试剂药物地塞米松磷酸钠注射液，免疫组织化学试剂IGF-（美国NeoMarkers公司生产），IGF-放免分析药盒（比利时Biocode-Hycel公司生产），SP超敏试剂盒，DAB显色试剂盒，Jem-100CX透射电镜，BI2000医学图像分析系统，FMJ-182型放免r计数器等。1、2早产孕鼠模型建立、用药与分组无交配史的成年Wister雌性大鼠18只，健康雄性大鼠3只，采用Stewart4动物模型。每日记录孕鼠体重，在雌鼠孕13天时，将其随机分为3组：对照组（CT组），地塞米松单剂量组（SD- DEX）,地塞米松多剂量组（MD- DEX组），每组孕鼠6只。CT组于孕鼠怀孕14天早9点给予生理盐水0.25ml颈部皮下注射，共一次；SD- DEX组于孕鼠怀孕第14天早9点颈部皮下肌注地塞米松0.1mg（0.25ml），共一次；MD- DEX组于孕鼠怀孕14天和15天早、晚9点颈部皮下肌注地塞米松0.1mg（0.25ml），共4次。在孕鼠怀孕16.5天行剖宫产术。1、3取材剖宫产从胎鼠羊膜腔抽取羊水1 ml，放入-20。C冰箱保存。取出胎鼠，断脐清理呼吸道，评价胎鼠肺成熟程度。胎鼠肺脏成熟采用两种技术评价：一是呼吸效果的特征，二是根据肺脏组织结构的发育。记录胎鼠数，出生体重（BW）、胎盘重量（PW）。孕鼠自心腔取血5 ml，离心后留取血清1 ml，放入-20。C冰箱保存。胎鼠胎肺、胎肝、胎盘制成石蜡标本，每组随机选取一只胎鼠肺脏留取制成电镜标本。胎鼠肺脏进行HE染色，观察胎鼠肺脏发育情况。1、4 胎鼠羊水和孕鼠血清中IGF-含量的测定采用包被试管放射免疫法。试剂盒组成包括：抗IGF-单抗包被管（100管），IGF-系列标准（6瓶冻干品），质控血清（2瓶冻干品）125-IGF-单抗 ，浓洗涤液（液体），样品稀释液。操作严格按照实际和说明进行。1、5 免疫组化染色胎鼠肺脏、肝脏和胎盘中IGF-的表达采用免疫组织化学的方法。染色判断标准：在无非特异性染色的情况下，IGF-以细胞核核膜和细胞浆出现棕黄色颗粒视为阳性细胞。每张经IGF-免疫组化的标本，在Olympus CX31型倒置光学显微镜下随机选取3个图像框，以每张切片染色的背景作对照，采用MIAS-2000图像分析仪计算及自动测量阳性细胞核核膜和细胞浆的平均光密度值。取3个图像框的平均值代表该标本的染色强度，根据染色强度间接判定胎盘、胎肝中IGF-的表达水平。4、统计学处理采用SPSS11.5软件进行统计分析。正态分布计量资料采用均数标准差（S）表示，多组计量资料经对数转换、方差齐性检验后，进行单因素方差分析并采用LSD法进行两两比较；方差不齐的数据进行非参数检验和两两比较。以P0.05为有统计学意义。2、实 验 结 果2、1物理学统计结果应用地塞米松后对胎鼠的肺脏成熟均有促进作用。HE病理切片下可见肺泡扩张完全，支气管发育良好。电镜下观察用药组肺泡腔完全扩张，细胞器发育良好，线粒体、高尔基体清晰可见，肺泡型细胞发育良好，可见正在释放表面活性物质的板层小体。见照片1-6 照片1、CT组胎鼠肺脏HE染色(*40) 照片2、SD-DEX组胎鼠肺脏HE染色（*40） 照片3、MD-DEX组胎鼠肺脏HE染色（*40） 照片4：CT组胎鼠肺脏超微结构， 照片5：SD-DEX组胎鼠肺脏超微结构， 照片6：MD-DEX组胎鼠肺脏超微结构未扩张的肺泡腔，发育不良的板层 型细胞内的板层小体和髓样物（*10000） 发育良好的板层小体，型细胞表面小体（*8000） 绒毛（*10000）2、2放射免疫法测孕鼠血清、胎鼠羊水中IGF-含量孕鼠血清IGF-含量在三个实验组中进行方差分析，F值0.642，P0.05,提示各组数据间无统计学意义。与CT组比较，SD- DEX组，MD- DEX组孕鼠血清中IGF-含量明显低于CT组，差异有统计学意义，P均0.05。SD- DEX组胎鼠羊水中IGF-含量明显低于CT组，差异有统计学意义，P0.05。孕鼠血清中IGF-含量（81.792739.6814）ng/mL远高于胎鼠羊水中IGF-含量（10.37593.7049）ng/mL，两者之间没有相关性。见表1。表1 三组孕鼠血清和胎鼠羊水中IGF-含量的比较（S，ng/mL）组别 例数 孕鼠血清 胎鼠羊水血清与羊水IGF-含量的t检验 t值 P值CT 6 90.053322.9044 11.64003.8559 -8.269 0.000SD-DEX 6 96.078330.2260 12.19334.1334 -6.735 0.001MD-DEX 6 73.560048.7158 6.52501.4885 -5.676 0.002注：与CT组比较，P0.01，P0.05。2、3免疫组织化学法测胎鼠肝脏、胎盘中IGF-表达IGF-免疫组化法染色阳性的肝细胞可见细胞浆内棕黄色颗粒，胎盘组织染色阳性的合体滋养细胞的核膜上出现棕黄色颗粒，负染苏木素者胞核见蓝色颗粒，阴性对照免疫组化反应为阴性。以阳性细胞的平均光密度值进行统计学分析。IGF-在三组胎鼠肝脏中的表达进行方差分析，F值4.747，P0.05，提示各组数据间有统计学意义。与CT组比较， SD- DEX组，MD- DEX组胎鼠肝脏中IGF-的平均光密度值均低于CT组，差异有统计学意义，P均0.01。IGF-在三组胎盘中的表达进行方差分析，F值8.417，P0.05，提示各组数据间有统计学意义。与CT组比较，SD- DEX组胎盘中IGF-的平均光密度值均低于CT组，差异有统计学意义，P0.05。进行同组间胎鼠肝脏与胎盘中IGF-平均光密度值的两均数比较，SD- DEX组两均数间有统计学意义，P均0.05。分别进行胎鼠肝脏与胎盘中IGF-平均光密度值的相关性分析，CT组（r=0.139，p=0.362）,SD- DEX组(r=0.106,p=0.543)，MD- DEX组(r=0.228,P=0.254)。SD- DEX组，MD- DEX组胎鼠肝脏与胎盘中IGF-平均光密度值之间具有正相关性，P0.05。见表2，照片7-12。表2 三组胎鼠肝脏和胎盘免疫组化结果比较（S） 组别 例数 肝脏 胎盘肝脏与胎盘IGF-的t检验 t值 P值CT 6 154.993810.8217 158.594510.3644 -1.612 0.111SD-DEX 6 148.620312.0034* 157.180913.5745* 2.966 0.004MD-DEX 6 152.243112.2095* 141.367211.9545 4.224 0.000注：与CT组比较，P0.01, P0.05 照片7-9：肝脏细胞胞浆内的棕黄色颗粒，CT组，SD-DEX组，MD-DEX组 照片11-12：胎盘组织合体滋养细胞内的棕黄色颗粒，CT组，SD-DEX组，MD-DEX组 2、4胎鼠出生体重、胎盘重量与不同组织中IGF-的相关性胎鼠出生体重与孕鼠血清IGF-具有负相关(r=-0.387，P0.05)；与胎鼠羊水中IGF- 有正相关(r=0.431, P0.05)。胎盘重量与孕鼠血清IGF-和胎鼠羊水中IGF-没有相关性；与胎鼠肝脏中IGF-有显著正相关(r=0.288,P0.05)。2、5三组孕鼠孕期体重增长情况三组孕鼠在受孕后体重均呈线性增长。CT组在怀孕第14天给生理盐水0.25ml肌注后，体重暂停增长后继续增长。SD-DEX组在怀孕第14天给单剂量糖皮质激素后，体重暂时下降，生长曲线呈锯齿状，体重下降1天后开始迅速回升。MD-DEX组在怀孕14、15天给予多剂量糖皮质激素后，体重下降持续时间1-2天后体重开始回升。见图1-3。 3、讨论 胰岛素样生长因子系统（IGFs）是一类既有胰岛素样合成代谢作用又有促生长作用的一类多肽，能介导生长激素（GH）促进多种组织细胞生长代谢，故IGFs对胚胎、神经、骨骼肌、骨骼的发育、细胞的增值、转化等具有重要的作用5。IGF-属胰岛素样生长因子系统（IGFs）家族中的一员，其精确的生物学效应取决于细胞发育的状态及其它激素或生长因子的存在。IGF-依赖于GH，可促进体外培养的多种细胞增殖，促进蛋白质和DNA合成。机体许多组织细胞均能自分泌和旁分泌IGF-。实验结果提示不同剂量的倍它米松可以促进胎鼠肺脏成熟，这与陈筱青的研究结果一致6在促进胎鼠肺脏成熟的同时，可减轻胎鼠的肺脏重量/BW、肝脏重量/ BW的值，但对胎鼠全脑重量/ BW、心脏重量/ BW的值在不同的剂量组有不同的结果7。胎儿在宫内生长发育调控机制一直是围生医学的研究热点之一。近来研究表明：营养物质-胰岛素-IGF代谢轴是调节胎儿和生后早期生长的重要途径8，其中IGFs中的IGF-起着举足轻重的作用。实验结果表明：孕鼠血清中IGF-含量远高于胎鼠羊水中IGF-含量，分别进行各组之间的相关性分析，没有统计学意义。说明，胎鼠羊水中IGF-不可能来自孕鼠，孕鼠血清中IGF-水平不能作为评价胎鼠生长发育的指标，孕鼠血清中IGF-不通过胎盘进入羊水影响胎鼠的生长发育。胎盘重量与胎鼠肝脏中IGF-有显著正相关,与胎盘中IGF-没有相关性。IGF主要来源于肝脏，利用IGF转基因动物及基因敲除模型发现，IGF-主要促进胎儿器官成熟9。目前胎盘IGFs系统基因表达的研究表明胎盘主要表达IGF-10，部分表达IGF-。胎盘IGF-主要由胎盘绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞及胎膜的平滑绒毛层细胞等合成分泌。胎盘合成和分泌的IGF-可以进入胎儿体内，IGF-进入胎儿体内的越多，胎儿获得的营养和养分循环也就越充分。胎儿体内IGF-增多，IGF-反过来作用于胎盘，通过影响胎盘IGF-的产量和改善胎盘功能，调节胎盘血流转运，增加胎盘对营养物质的摄取，促进胎儿生长11，达到其调节胎儿脏器发育和体重的目的。外源性的糖皮质激素从母体不经过胎盘代谢，直接进入胎儿体内发挥作用。正常情况下，胎儿糖皮质激素水平远远低于母体，这是由于胎盘的11-羟甾类脱氢酶的作用，它催化皮质醇和皮质酮快速代谢成11-酮形式（氢化可的松，11-脱氢皮质酮），使大部分来自母体的皮质醇失活。孕期孕鼠应用地塞米松后，使过多的糖皮质激素进入胎儿体内，导致严重高血糖，直接影响到胰岛素及IGF的功能。孕鼠血清IGF-水平在应用不同剂量的地塞米松后，与CT组比较， SD-DEX组，MD-DEX组低于CT组，孕鼠体重增长小于CT组。说明孕鼠血清IGF-含量的高低与孕鼠体重有着直接的关系。孕妇血清中的IGF-不经过胎盘屏障，即可起到调节胎儿营养供给，促进胎儿正常发育的作用12。应用地塞米松后，导致孕鼠处于应激状态，机体处于高代谢状态，对葡萄糖的需要量明显增加，通过加速肝糖元的分解来提高血糖浓度，胰高血糖素和GH的循环浓度也呈升高趋势13。正常情况下，血清IGF-水平主要受GH调解，血清IGF-水平可反映GH状态， IGF-、GH之间存在反馈调节系统：一方面GH促进IGF-的合成、释放14；另一方面，IGF-又能增加下丘脑生长抑素的分泌，抑制生长激素释放或直接抑制垂体生长激素细胞合成生长激素，从而降低生长激素的水平。推测，应用不同剂量地塞米松后，抑制了孕鼠IGF-的分泌，IGF-的降低负反馈的引起GH升高，导致孕鼠体重的变化。孕鼠体重暂时性下降，体重下降与用药剂量和次数有关，随着药物在体内的代谢，药理作用的丧失，这种抑制作用逐渐解除，并且在进行剖宫产时孕鼠体重都恢复至用药前体重并有不同程度增长。目前产科领域的研究发现，IGF-与妊娠高血压疾病、胎儿生长受限、妊娠期糖尿病等一些产科疾病有关15。国外有用IGF-治疗胎儿生长受限的报告，这对于临床治疗该种疾病的患者提供了一种更好的方法，值得期待。 参 考 文 献1 Berkowitz GS,Paoiernik E.Epidemiology of preterm birth.Epidemiol Rev,Jan 1993,15:414-443.2 Liggins GC. Premature delivery of fetal lambs infused with glucocorticoid.J Endocrinol,Dec 1969;45(4):515-523. 3Effect of corticosteroids for fetal maturation on perinatal outcomes. NIH Consensus Development panel on the Effect of Corticosteroids for Fetal Maturation on Perinatal Outcomes. JAMA,Feb 1995;273:413-418.4Stewart J,Gonzalez C,Christina l,et al.Impact of multiple antenatal doses of betamethasone on growth and development of mice offspring.Mosby-Year Book Inc,1997,177(5),1138-1144.5 Bowman P,Mclaren A.Cleavage rate of mouse embryos in vivo and in vitro.J Embryo Exp Mor Phol.1970,24:203.6陈筱青，周晓玉，阚青等.地塞米松和地塞米松对大鼠胎肺形态发育影响的对比.中华围产医学杂志.2009年12卷1期，36-40.7陈贵岭，成要平等.地塞米松对早产胎鼠生长发育的影响及与IGF-的相关性.现代妇产科进展.2008年6月第17卷第6期，428-432.8潘革,李慧玲,林广等.宫内生长迟缓GH、IGF-1、IGFBP-3和瘦素水平及临床意义.中国儿童保健杂志.2007,2(1),16-18.9Stewart CE,Rotwein P.Growth,differentiation,and survival:multiple