基因扫描分析非小细胞肺癌病人外周血和骨髓T细胞克隆性增殖及分布特点.doc

癌症 2000年第3期第19卷 基础研究作者：吴一龙杨学宁李锦添王思愚单位：吴一龙（中山医科大学肺癌研究中心，广东广州510060）；杨学宁（中山医科大学肺癌研究中心，广东广州510060）；李锦添（中山医科大学肺癌研究中心，广东广州510060）；王思愚（中山医科大学肺癌研究中心，广东广州510060）关键词：T细胞受体；V基因；T细胞克隆；非小细胞肺癌摘要：目的：分析非小细胞肺癌（nonsmallcelllungcancer,NSCLC）病人的T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)V亚家族T细胞的分布及其克隆性增殖特点。方法：利用RTPCR和基因扫描方法分析3例NSCLC外周血和骨髓单个核细胞中24个TCRV基因的CDR3长度，了解TCRVT细胞的分布及其克隆性。结果：3例病人仅存在15个TCRV亚家族，主要为V3、V7和V9，2例病人出现V7寡克隆性增殖T细胞，另1例发现V3的寡克隆T细胞。结论：NSCLC病人外周血或骨髓的TCRV亚家族出现倾斜性分布和克隆性增殖T细胞，主要为V3和V7亚家族T细胞，这可能是由肺癌细胞相关抗原引起的特异性免疫反应的T细胞克隆。分类号：R371.2；R734.2文献标识码：A文章编号：1000467X(2000)03020404The feature of clonal expansion and distribution of TCR VT cellsfrom peripheral blood and bone marrow in patients with NSCLCWU YilongYANG XueningLI Jintianet al.（Lung Cancer Research Center, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, P.R.China ）Abstract：Objective： To investigate the distribution and clonal expansion of TCR V subfamily T cells in patients with non small cell lung cancer (NSCLC). Methods： The CDR3 size of TCR V 24 subfamily genes were analyzed in peripheral blood and bone marrow mononuclear cells from 3 cases with NSCLC using RTPCR and genescan, to evaluate the distribution and clonality of TCR V T cells. Results： Only 1 5 V subfamily T cells could be identified in NSCLC cases, the V subfamily T cells main expressed were V 3, V 7 and V 9. V 7 oligoclonal T cells were identified in two cases, whereas V 3 oligoclonal T cells were detected in the other case. Conclusions： The skew distribution and clonal expansion of TCR V subfamily T cells could be found on patients with NSCLC, predominantly in V 3 and V 7. It may be the T cell clones for specific immune response due to the lung cancer cells associatedantigen.Key words：NSCLC； T cell receptor； V gene； T cell clonalityT细胞受体（Tcellsreceptor,TCR）是T细胞表面识别和结合抗原、参与特异性细胞免疫的重要分子。在T细胞发育过程中，其可变区（V）、多样区（D）和结合区（J）的基因片段进行重排，重排时在V-D，D-J区连接之间可有不同数量的核苷酸随机插入（N区）,形成具有高度多样性的可变化区VNDNJ，称为互补决定区(CDR3)1。同一克隆T细胞重排后，其CDR3长度和序列完全相同，而不同克隆T细胞的CDR3长度和序列有所不同，其长度的差别可为324个碱基，对CDR3长度和序列的分析，可以作为判别T细胞克隆性的指标1。利用RT-PCR和基因扫描方法分析TCRV24个亚家族的CDR3长度确定T细胞克隆性是国外近年开展的新方法2，用于分析肿瘤病人外周血或肿瘤组织浸润性T细胞中的克隆性增殖T细胞情况，借此深入了解机体对肿瘤细胞相关抗原的特异性反应情况2,3。本研究利用该方法分析3例NSCLC病人外周血和骨髓TCRVT细胞的分布及其克隆性。1材料和方法1.1样本经病理确诊的NSCLC病人3例，其中肺鳞癌2例（L1、L2），肺腺癌1例（L3）。细胞株Molt-4和Jurkat作为单克隆对照，10例正常人作为多克隆对照，B细胞株Raji作为阴性对照。骨髓取自手术中所切的部分肋骨，外周血和骨髓单个核细胞的分离按常规方法进行。1.2RNA提取和cDNA合成RNA提取应用RNAzol试剂盒（Gibco，BRL）并应用随机引物和反转录酶试剂盒（SuperscriptII，Gibco，BRL）反转录合成cDNA第一链。均按常规方法进行。1.3引物用于非标记PCR的24个V引物和一C引物，用于runoffreaction的5端荧光素标记的C-fam引物和用于序列分析的5端生物素标记的C-bio引物均由德国柏林TIBMOLBIOL公司合成。引物的核苷酸序列见表12,4。表1用于TCRVPCR的引物的序列PrimerSequenceV15CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCV25GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGAV35CGCTTCTCCCGGATTCTGGAGTCCV45TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAAV55AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCCV65TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGGV75CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTCV85CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGCV95TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGCV105CCACGGAGTCAGGGGACACAGCACV115TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCAV125TGTCACCAGACTGGGAACCACCACV135CACTGCGGTGTACCCAGGATATGAV145GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTACV155CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTGV165GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGGV175CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCCV185TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCAV195TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCAV205AGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTCV215TCCAACCTGCAAGGCTTGACGACTV225AAGTGATCTTGCGCTGTGTCCCCAV235GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCAV245CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCCC5CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCGCFam5Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG1.4RT-PCRPCR按所报道的方法进行2,4。总反应体积为25l，其中含1lcDNA，任一V引物（24个V引物之一）和C引物（0.5mol），0.1mmoldNTP,1.25UTaq聚合酶(PerkinElmer)和1PCR缓冲液。反应在PCR扩增仪(PerkinElmer)中进行。共进行40循环，每一循环包括：94、1min（首次3min）,60、1min和72、1min（末次10min），PCR产物保存于4中备用。1.5T细胞克隆性分析1.5.1Runoffreactions（标记PCR产物）：10l的反应体系含2l的未标记的PCR产物、0.1MCfam引物、3mmolMgCl2,0.2mmoldNTP,0.25UTaq聚合酶和PCR缓冲液(PerkinElmer)。PCR共进行35循环，退火温度为66，余同上4。1.5.2基因扫描分析（CDR3长度分析）：有关操作步骤按使用指南进行。荧光素标记的PCR产物（2l）加入2.5l甲酰胺，0.5lGenescan-500Tamra分子量标准品(ABI,PerkinElmer)和0.5l加样缓冲液(Dextran50mg/ml,EDTA25mmol,Genescan-500TamraKit)，经94、4min变性后，于6聚丙酰胺凝胶中电泳，经373ADNA序列仪（ABI,PerkinElmer）的基因扫描672分析软件分析产物的长度和荧光素强度。1.5.3结果判定：由于V和C引物是固定的，故V/C所扩增的PCR产物的大小决定于V-D、D-J之间重排时的连接片段N区和D的长短，即VNDNJ(CDR3)，不同的T细胞克隆的PCR产物长度和含量有所不同，通过PCR产物的状况，便可了解体内T细胞克隆存在的情况。经荧光素(fam)标记的产物通过基因扫描软件分析，电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰表示产物的大小和含量；峰的形态提示产物的均一性（克隆性），当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时，电泳时，其迁移率完全相同，故在同一时间点通过扫描探头，所显示的结果为一单峰图象，提示为PCR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞，即单克隆的细胞；而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性；而多峰图象提示多克隆性4,5。2结果2.1TCRV亚家族T细胞的表达情况RT-PCR扩增结果：3例病人外周血和骨髓分别存在15个V亚家族（表2），正常人表达所有的24个TCRV亚家族，Molt-4和Jurkat细胞则均为表达单一TCRV的T细胞，分别为V2和V8T细胞。B细胞株Raji不表达任何TCRV基因。表2RTPCR和基因扫描分析TCRV亚家族T细胞克隆性的结果引物病例L1病例L2病例L3PB*1BM*2PBBMPBBMV3poly*3polypolyoligooligoV5polyV6polyV7oligo*4bi*5V9polypoly注：1：外周血，2：骨髓，3：多克隆，4：寡克隆，5：双克隆2.2T细胞克隆性分析结果基因扫描分析结果显示：Molt-4和Jurkat的V2或V8PCR产物均呈单峰图象（单克隆性）；正常人的全部PCR产物呈多峰图象（多克隆性），2例肺鳞癌病人中，1例（L1）在骨髓中发现其V7的PCR产物均呈一主峰及个别矮峰图象（寡克隆），另1例（L2）在外周血中其V7的PCR产物呈双峰图象（双克隆），另1例肺腺癌的外周血和骨髓中的V3PCR产物均呈寡克隆图象，其余的VPCR产物均呈多峰图象（多克隆）（图1）。图1基因扫描分析TCRV细胞克隆性结果左图：病例L1骨髓中所存在的TCRV7家族T细胞，呈一主峰图像（寡克隆性）。右图：病例L2外周血中所存在的5个TCRV亚家族的克隆性分布特点，V7呈双峰图像（双克隆性）;余为多峰图像（多克隆性）。3讨论本研究利用RT-PCR分别扩增3例NSCLC病人外周血和骨髓单个核细胞的TCRV24个亚家族基因，了解病人各V亚家族T细胞的分布情况。结果显示病人的TCRV亚家族T细胞出现了明显的倾斜性，或称为选择性表达及优势利用的情况，根据细胞免疫学的基本原理，该结果应与病人存在某些特异性抗原（如肺癌细胞相关抗原等）所引起的刺激有关，另一方面，由于其它亚家族T细胞的减少，可能与肺癌病人部分细胞免疫功能缺陷有关。用基因扫描对TCRV阳性的PCR产物进一步分析其均一性，即分析CDR3的长度，了解T细胞克隆性。结果显示，2例肺鳞癌病人的骨髓或外周血的V7和1例肺腺癌病人的外周血和骨髓的V3亚家族T细胞为寡克隆性或双克隆性T细胞，寡克隆T细胞提示在该V亚家族中绝大部分的细胞都来自同一克隆，只有极小部分来自其他的克隆，双克隆是两个等位基因出现两种重排的结果，两者均提示该家族的T细胞为克隆性增殖的T细胞，这种克隆性增殖的T细胞可能是机体对肿瘤细胞相关抗原的一种直接反应，近期Echchakir等8有关肺癌组织中的TCRV亚家族分析也证明了这一点。目前多数研究报道均未有明确提出哪种肿瘤与哪一个或哪些TCRV亚家族T细胞克隆有关。在同一种肿瘤的不同病例中出现的克隆性增殖T细胞不一定相同，并可能出现一个或多个TCRV亚家族T细胞克隆，其原因一方面由于病例数少，未能更好地发现其共性，另一方面，也可能与个体特异免疫和肿瘤的异质性有关1,2,4,5。值得注意的是2例肺鳞癌病人中有均同时出现V7亚家族的克隆性增殖T细胞，提供了一定的趋向性，这些T细胞的真正功能有待积累病例做进一步的研究。在黑色素瘤病人的研究中，Puisieux等2发现在同一病人的不同部位活检组织的TIL和不同时间的TIL表现相同的克隆性T细胞，提示这些克隆性增殖的细胞是对肿瘤相关抗原的免疫反应。Maccalli等6证明了表达某些TCRV的克隆性T细胞对自身肿瘤细胞的特异杀伤作用。最近Semino等9更发现V3和V7阳性的T细胞为自身肺癌细胞的特异性细胞溶解性淋巴细胞，为本研究的深入提供了可喜的证据。目前利用病人克隆性增殖T细胞作为特异性免疫治疗的研究已开展7，但对肺癌的类似研究甚少。本研究在国内首先报道NSCLC克隆性增殖T细胞的情况，对这些克隆性增殖T细胞对肺癌特异性杀伤作用做深入的分析，是一项十分有意义的工作。基金项目：本课题受卫生部科学研究基金(982377)资助通讯作者：吴一龙：Tel：862087580159 Fax：862087536401 Email：参考文献：1Sensi M, Parmiani G. Analysis of TCR usage in human turmors： a new tool for assessing tumot specific immune response J. Immunol today, 1995, 16： 588 595.2Puiseux I, Even J, Pannetier C, et al. Oligoclonality of tumor-infiltrating lymphocytes from human melanomas J. J Immunol, 1994, 153： 2807 2818.3Thor Straten P, Guldberg P, Gronbeak K, et al. In situ T cell responses against melanoma comprise high numbers of locally expanded T cell clonatypes J. J Immunol, 1999, 163： 443 447.4李扬秋,汪明春,吴幼华.利用基因扫描分析TCRV亚家族的CDR3长度的方法检测T细胞克隆性J.中国免疫学杂志,1998,14：4850.5李扬秋,吴一龙.TCRV基因谱系在检测肿瘤病人T细胞克隆性中的研究J.国外医学肿瘤学分册,1999,26：137139.6Maccalli C, Farina C, Sensi M, et al. TCR beta-chain variable region-driven selection and massive expansion of HLA-class I-restricted antitumor CTL lines from HLA-A* 02