辛伟杰硕士论文2.doc

分类号 S188 学 号2005103098 硕士学位论文通过RNAi研究水稻磷转运蛋白基因生理功能指导教师 徐国华教授 胡江讲师 专业名称 植物营养 研究方向 植物营养分子生物学 答辩日期 二八年六月 辛伟杰 Functional Analysis of Rice Phosphate Transporter Genes through RNA InterferenceBy Xin WeiJieA Thesis Submitted to Nanjing Agricultural UniversityForMaster degree of AgricultureSupervised byProfessor Guohua Xu and Lecturer Jiang HuCompleted in June，2008原 创 性 声 明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。 （请在以上方框内打“”）学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日导师（需亲笔）签名： 年 月 日目录摘要I关键词IIABSTRACTIIIKey worksIV第一部分 文献综述11 水稻基因组学研究趋势12 RNAi技术概述22.1 RNAi技术的发现及其原理介绍22.2 RNAi的技术特点32.3 RNAi在植物基因功能研究中的应用42.4 RNAi技术应用的问题与展望63 植物磷转运蛋白基因表达调控和功能研究现状63.1 植物适应土壤磷缺乏的适应机制63.2 植物磷酸盐转运蛋白的研究现状73.3 水稻磷转运蛋白研究现状8第二部分 研究思路与材料方法91 研究思路91.1 实验流程设计101.2 主要研究内容102 材料与方法112.1 载体构建112.2 农杆菌介导转基因182.3 基因生理功能分析22第三部分 结果与分析311 沉默效果检测与沉默株系选择312 基因表达情况与同位素示踪结果322.1 目标基因RT-PCR与同位素示踪结果322.2 Pht1家族基因的表达情况分析333 植株干重及植株总吸磷量分析383.1 植株干重383.2 植株总吸磷量394 根系形态分析404.1 根系总长度404.2 根系表面积414.3 根系体积424.4 根尖数435 种子发芽情况分析43第四部分 讨论461 目标基因的RNAi效果462 Pht1家族其他基因成员表达变化463 沉默突变体表型分析以及OsPT2和OsPT6的生理功能47第五部分 全文结论49参考文献50在读硕士期间发表的论文58致谢59III摘要通过RNAi研究水稻磷转运蛋白基因生理功能摘要作为单子叶模式植物的水稻基因组测序工作已经完成，水稻功能基因组学已成为水稻科研工作的重心。磷酸盐转运蛋白基因在缺磷条件下的强烈表达是水稻适应低磷胁迫的重要机制之一。与磷胁迫相关的磷酸盐转运蛋白基因的生理功能研究，可从分子水平上解释水稻适应低磷胁迫的遗传本质，为水稻对磷营养吸收转运规律的发现、磷肥的科学施用以及水稻产量的维持和提高等提供理论依据。本实验以粳稻日本晴品种为实验材料，通过RNAi分别创造水稻Pht1家族成员中两个缺磷强烈增强表达的基因，OsPT2和OsPT6的沉默突变体，并以沉默效果显著的转基因株系为供试对象进行目标基因的生理功能分析。测定了磷胁迫条件下目标基因的沉默情况，同位素32P示踪吸收情况，Pht1家族大部分基因成员的表达情况，植株干重，植株总磷吸收量，根系形态，种子发芽率等指标，以研究OsPT2和OsPT6基因在水稻磷营养吸收和转运方面的功能。所获得的主要结果如下：以pTCK303为原初载体构建RNAi表达载体的水稻转基因可以导致转基因株系目标基因OsPT2和OsPT6的不完全沉默。不同株系基因沉默程度不一，在缺磷处理条件下，被选作研究材料的两个OsPT2沉默株系r2-1和r2-2，地下部目标基因的沉默程度分别为78.2%和25.7%；地上部目标基因的沉默程度分别41.2%和22.7%。三个OsPT6沉默株系r6-1、r6-2和r6-3，地下部目标基因的沉默程度分别为85.3%、77.5%和45.5%；地上部目标基因的沉默程度分别73.9%、70.1%和71.4%。OsPT2或OsPT6基因的沉默同时影响了同家族其他基因的表达。在缺磷处理条件下，OsPT2的沉默突变体中，以r2-1为例，地下部OsPT1、OsPT6、OsPT8、OsPT12基因的表达均有不同程度的降低，OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT7、OsPT9、OsPT10基因表达均有不同程度的上升；地上部OsPT1、OsPT5、OsPT6、OsPT7 、OsPT9基因的表达均有不同程度的降低，OsPT3、OsPT4、OsPT8、OsPT10、OsPT12基因表达均有不同程度的上升。在OsPT6的沉默突变体中，以r6-1为例，地下部OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT5、OsPT7、OsPT8、OsPT9、OsPT12 基因的表达均有不同程度的降低，OsPT4、OsPT10基因表达有不同程度的上升；地上部OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT7、OsPT8、OsPT9、OsPT12基因的表达均有不同程度的降低，只有OsPT10基因表达有微弱的上升。OsPT2或OsPT6基因的沉默都会造成低磷条件下水稻植株干重、植株总吸磷量、总根长、根系总表面积、根系体积、根尖数等指标不同程度的降低。此外，OsPT6基因高效沉默株系r6-1的种子发芽率和种子发芽速率显著低于野生型。综合全文的研究内容可得到以下结论：以pTCK303为原初载体的RNAi表达载体构建，能对目标基因实现有效沉默，显著降低目标基因的表达量，但沉默效果不完全。OsPT2或OsPT6的有效沉默会造成同家族其他磷转运蛋白成员表达量的变化，预示着OsPT2和OsPT6基因与Pht1家族其他成员之间可能存在着功能互作效应。OsPT2或OsPT6的有效沉默会显著降低低磷条件下水稻植株干重和植株总吸磷量，说明OsPT2和OsPT6在低磷条件下维持水稻植株正常生长和磷吸收、转运方面起着十分重要的作用。OsPT2或OsPT6基因的有效沉默会引起低磷胁迫条件下水稻根系总长度、根表面积、根系体积和根尖数等指标的普遍下降，从而造成水稻的根系形态的改变，但这种影响是这两个转运蛋白的直接作用还是通过对水稻体内磷营养状况的改变引起的间接效应有待进一步研究。OsPT6基因的高效沉默会显著降低水稻种子的发芽率和发芽速度，说明OsPT6在水稻种子的磷吸收、同化和转运方面可能起着重要作用。关键词：水稻；磷转运蛋白；RNA干涉；基因沉默；根系形态；种子发芽注：OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT6、OsPT7、OsPT8、OsPT9、OsPT10、OsPT11、OsPT12、OsPT13分别代表水稻Pht1家族的13个成员。ABSTRACTFunctional Analysis of Rice Phosphate Transporter Genes through RNA InterferenceABSTRACTThe genome sequencing of rice (Oryza sativa), a model plant of monocotyledon, has been finished. Rice functional genomics has become one of the research focuses in plant biology. One of the key mechanisms of rice to adapt the phosphate deficiency is enhancing expression of some phosphate transporter genes. In the rice genome, a total of 13 sequences can be identified as belonging to phosphate transporter (Pht1) family. Understanding of the physiological functions of phosphate transporters is essential for dissecting the molecular mechanism of phosphate uptake, translocation and utilization by plants. In our previous experiments, we observed that two rice phosphate transporter genes in Pht1 family, OsPT2 and OsPT6, were expressed abundantly under P starvation condition. In the present study, one of the rice cultivars belong to the subspecies of Japonica for genome sequencing, Nipponbare, was chosen for knockdown of OsPT2 and OsPT6 through the technique of RNA interference (RNAi). The suppression of target genes, isotopic absorption, mRNA expression of most Pht1family members, dry weight, total phosphate uptake, root configuration, seed germination ratio in the RNAi knockdown T1 generation were measured in comparison to the wild type to explore the functions of OsPT2 and OsPT6 gene on phosphate absorption and transportation.The main results obtained were as follows:The mRNA expression of OsPT2 and OsPT6 were effectively suppressed but not to a complete level by transformation of the targeted genes with RNAi vector construction basing on pTCK303. There were very large differences of the suppression of the targeted gene among different lines treated with low Pi concentration. The inhibition rate of OsPT2 mRNA expression in r2-1 and r2-2, the two OsPT2 RNAi transgenic lines were 78.2% and 25.7% in the roots, 41.2% and 22.7% in the shoot, respectively. While the inhibition rate OsPT6 mRNA expression in r6-1, r6-2 and r6-3, the three OsPT6 RNAi transgenic lines were 85.3%、77.5% and 45.5% in the roots, 73.9%、70.1% and 71.4% in the shoot, respectively.The knockdown of either OsPT2 or OsPT6 by the RNAi also affected the expression of other Pht1 family members in the rice treated with low P solution. In the r2-1 mutant, the expression of OsPT1、OsPT6、OsPT8、OsPT12 relative their expression in the wild type were down regulated, and OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT7、OsPT9、OsPT10 were up regulated in the roots; meanwhile, OsPT1、OsPT5、OsPT6、OsPT7 、OsPT9 were down regulated, and OsPT3、OsPT4、OsPT8、OsPT10、OsPT12 were up regulated in the shoot. In the r6-1 mutant, the expression of OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT5、OsPT7、OsPT8、OsPT9、OsPT12 relative their expression in the wild type were down regulated, and OsPT4、OsPT10 were up regulated in the roots; meanwhile, OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT7、OsPT8、OsPT9、OsPT12 were down regulated, and only OsPT10 were faintly up regulated in the shoot.Knockdown the expression of either OsPT2 or OsPT6 decreased the total phosphate absorption, dry weight, total root length, total root surface area, root volume, root numbers under low P supply condition. In addition, the germination ratio and speed of the r6-1 seeds were markedly lower than that of the wild type seeds.The results indicated that OsPT2 and OsPT6 played very important roles in the uptake and translocation of Pi, as well as in regulation of root growth in the rice. The regulated expression of many other Pi transporters by knockdown of OsPT2 and OsPT6 there was a possible functional interaction among OsPT2, OsPT6 and other members of Pht1 family.at te inhibition e absorption of root length, total root surfficKey works: Rice; Phosphate transporters; RNA interference; Gene silencing; Root morphology; Seed germination第一部分 文献综述第一部分 文献综述1 水稻基因组学研究趋势水稻是世界最主要的粮食作物之一，在人口压力逐渐增大的当今世界，水稻产量的维持和增加对于保障世界粮食安全具有举足轻重的作用。另外，随着人民生活的不断提高，水稻生产在保持粮食总量平衡的基础上也面临着向多样化、高品质方向发展的要求。功能型水稻的育种技术如常规育种、诱变育种、分子辅助标记育种、转基因育种等的进一步发展，急需完善而系统的基础理论支持。广泛而明确的水稻基因功能注释将是突破这一发展瓶颈的重要手段。禾谷类作物中基因组规模最小的水稻，因其易于遗传操作且与其他禾谷类作物存在共线性，被公认为遗传学和基因组学研究的模式植物（Arumuganathan 等，1991；Izawa 等，1996）。在2000年完成只有5条染色体的双子叶植物拟南芥的全基因组测序以来（The institute for Genomic Research : http :/ / www. tigr. org）以后，单子叶模式植物水稻的全基因组工作框架图和基因组全长序列的测定工作也在2002年完成（Yu 等，2002；Goff 等，2002；Sasaki 等，2002；Feng 等，2002；Yeisoo 等，2003；Hsing 等，2005）。水稻基因组大小为389Mb，已鉴定的37,544个基因中有29%以基因家族的形式出现。90%的拟南芥蛋白被认为是与水稻蛋白质组同源（Hsing 等，2005）。 近年来，杨树、葡萄、番木瓜等全基因组测序也已经完成（Tuskan 等，2006；Jaillon 等，2007；Ming 等，2008），最新的已测序植物基因组统计结果如表1-1所示。植物科学研究已进入后基因组时代，作为农作物的水稻以其在粮食生产中的重要地位和基因组独特的科研优势一直是科研工作的焦点所在，水稻功能基因组学研究已成为当务之急。后基因组时代的到来使得许多功能基因组学研究方法不断出现，并在实际应用中不断发展和完善。包括表达序列标签（expressed sequence Tag, EST）、基因芯片技术、生物信息学、功能基因组系统学、蛋白质组学、基因表达系列分析、T-DNA插入突变技术、物理化学诱变技术、RAN干扰技术、转座子和反转录转座子等。这些方法的出现和广泛应用为水稻功能基因组学的发展开辟了广阔的道路。表1-1 已测序植物基因组统计表(Ming 等，2008)Table 1-1 Statistics of sequenced plant genomes (Ming 等，2008)番木瓜Carica papaya拟南芥Arabidopsis thaliana杨树Populus trichocarpa水稻Oryza sativa(japanica)葡萄Vitis vinifera基因组大小（Mbp）Size(Mbp)372125485389487染色体数目Number of chromosomes95191219G+C总含量（%）G+C content total (%)35.335.033.343.036.2基因数量Gene number2474631114455553754430434基因平均长度（bp/基因）Average gene length (bp per gene)23732232230028213399内含子平均长度（bp）Average intron length (bp)479165379412213转座子比例（%）Transposons (%)51.9144234.841.42 RNAi技术概述2.1 RNAi技术的发现及其原理介绍RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA 介导的、在转录后mRNA 水平关闭相应基因表达的过程。也就是序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)（李兰岚等，2005）。自从1990年Jorgensen和Mol等在对矮牵牛的研究中意外地发现了RNA沉默现象（最初命名为共抑制（co-suppression）以后（Napoli 等，1990；Marcel 等，2002），RNA干扰，随后在线虫、果蝇、斑马鱼和哺乳动物细胞中也相继被发现。大多数生物体能利用RNA干扰机制来抵御病毒及其它外来核酸的侵入。根据目前关于RNA干涉(RNA interference, RNAi)机理的报道（Agrawal等，2003；Gregory等，2002；Gunter等，2004），RNAi主要包括两个过程：（1）起始步骤(initiation step)。外源或内源双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)被降解为小至21到28个核苷酸的小双链RNA片段。这些小双链RNA被称为小分子干扰RNA片段(small interferencing RNAs, siRNA)。（2）效应步骤(effector step)。小分子RNA识别介导mRNA的特异性降解。在过程（1）中，起关键作用的是一种叫Dicer的能特异性识别dsRNA的核酸内切酶RNase III。该酶具有RNase III接触反应区域(catalytic RNase III domains)和双链RNA结合区域(dsRNA-binding domains, dsRBDs)。dsRBDs 负责与dsRBNA相结合，而RNase III接触反应区域则与RNase III作用产物siRNA的大小有关。Balszczyk的报道显示，RNase III接触反应区域能致使Dicer将dsRNA分裂成成22个核苷酸的大小（Blaszczyk等，2001）。在过程（2）中，起关键作用的是RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)。根据网站关于RNAi原理flash演示的介绍，RISC具有四种酶的活性：RNA-DNA螺旋酶(RNA-DNA helicases)活性、核酸内切酶(endonucleolytic nuclease)活性、核酸外切酶(exonucleaolytic nuclease)活性和序列同源识别活性(homology-searching activity)。在四种酶活性的共同作用下，siRNA与RISC结合为一体，根据碱基互补配对原则识别同源的mRNA序列，引导RISC结合到mRNA的特定位置，从而实现目标mRNA的特异性降解。2.2 RNAi的技术特点在RNAi的研究过程中，RNAi技术表现出许多独特的优点：（1）系统性。近年来对烟草的研究发现RNA沉默信号不仅可以通过胞间连丝在胞质和胞核间或细胞间短距离运输，而且可以通过韧皮部进行长距离传递（Hamlitaon等，1999；Elbashir等，2001；Voinnet等，1998；Li 等，2006）。其实，由RNAi引起的沉默现象可以传递到植物体的任一部位，甚至接穗（周小云等，2005）。(2)放大效应。1998年，Fire等对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）注射双链RNA的研究发现，只需对每个细胞注射数个双链RNA分子即可实现RNA干涉，由此推断dsRNA或siRNA在RNA干涉过程中可能存在一种扩大反应过程（Fire等，1998）。2001年cell的报道中，Sijen对秀丽隐杆线虫的进一步研究发现，起干涉作用的siRNA不仅来源于dsRNA的降解，还来源于以mRNA为模板的扩增反应，该反映受到一种被称为RNA定向RNA聚合酶（RNA-directed RNA polymerase; RdRP）的蛋白所催化（Sijen等，2001），为RNA干涉的放大效应提供了新的证据。还有报道显示，少量dsRNA就能引起基因沉默以致延至整个生物，表明dsRNA或起催化作用或被扩增或两者兼而有之（周玲艳等，2003；Fire等，1999）。(3)特异性。dsRNA的阻断作用是特异的。从RNA干涉的原理上看，目标基因的沉默是由于mRNA的特异性降解导致细胞不能翻译出相应的功能蛋白，进而使生物表现目标基因功能缺陷所致，而mRNA的降解是由dsRNA分裂或放大作用产生的siRNA所介导的。因此，在RNA干涉过程中，我们可以通过有目的地选择dsRNA序列去有针对性地沉默我们所感兴趣的基因。还可以通过选择几个基因的相对保守区段来构建RNA干涉载体来实现几个基因的同时沉默。(4)高效性。Bezanilla等利用苔藓Physcomitrella Patten为材料，分别对报告基因GUS和GFP进行RNA干涉，通过玉米ubiquitin 启动子启动产生具发夹结构的双链RNA（hairpin RNA, hpRNA）并分别用微粒轰击法和原生质体转化法进行转基因，从而获得目标基因表达显著受抑而且能稳定遗传的转基因植株（Bezanilla等，2003）。Wesley 等在2001年的报道（Wesley等，2001）中提到，在细胞中表达具有发夹结构的双链RNA比往细胞里单一或混合注射正义或反义单链RNA更能抑制目标基因的表达。在发夹结构与其启动子间插入一段内含子序列能显著增强RNA干涉的效果。含有内含子的发夹结构RNA(intron-containing hairpin RNA, ihpRNA)能保证90%-100%的转基因植株产生显著的干涉效果。98853bp长度的正反义臂构成的发夹结构均能有效实现目标基因的沉默。 (5)时空表达可调控性。RNA干涉可以特异性地沉默我们所感兴趣的基因，以获得该基因的功能缺失突变体，从而进行基因功能分析。然而，当我们所感兴趣的基因的功能缺陷会导致植株致死时，则会使我们不能获得所需的突变体，使基因的功能研究工作无法进行。RNA干涉可以引入可调控表达系统，如通过可诱导的启动子表达hpRNA，从而控制目标基因沉默的时间、位点和程度，使得我们所感兴趣的基因沉默仅发生在相应的器官或特定的发育阶段。这样可以有效克服由于基因功能缺失致死而不能获得相应的突变体材料的弊端。Guo等利用烟草和番茄作实验材料，通过一个叫Cre/loX P(CLX)的化学诱导系统引发ihpRNA的表达，获得了时空表达可调控，并实现目标基因高效沉默的突变体植株。美中不足的是，该系统需要通过农杆菌渗透法（Voinnet等，1997）（Agrobacterium infiltration）或来源于的载体（Dalma等，2000；Peele等，2001；Ratcliff等，2001；Turnage等，2002）（virus-derived vectors）进行转基因，而这两种方法所获得的基因沉默效应只是暂时的，而且不可遗传（Guo等，2003）。Chen等利用酒精诱导的启动子启动ihpRNA的表达，成功地控制了RNA干涉的时空性，只是他们所获得的干涉效应也比较短暂（Chen等，2003）。但这些研究已经足以说明RNA干涉可以实现时空表达的控制。这一点使RNA干涉手段具有其他基因敲除手段所无可比拟的优势，使RNA干涉在基因功能分析中具有更广泛的灵活性。2.3 RNAi在植物基因功能研究中的应用随着反向遗传学的兴起及其广泛应用，获得功能缺失突变体以从表型的变化推测基因的功能一直是研究植物功能基因组比较直接的方法。在RNA干涉技术被广泛应用以前，人们曾利用T-DNA和转座子插入突变、化学诱变剂、化学诱变等方法来获得功能缺失突变体。辐射和化学诱变剂产生的突变体须通过测序或作图的方法来确定其突变位置，突变的随机性很大必须产生大量的突变株才有可能筛选到所需的突变体，这就意味这需要投入巨大的工作量。T-DNA和转座子插入突变可以已知的插入序列推测出旁侧的基因序列，从而确定其突变位置。但插入突变的方法不能定位于植物基因组的特定部位，也具有一定的随机性。而且当有多个转座子或T-DNA插入时，会造成植株的表型混乱，不利于突变体的筛选和分析。在基因组大规模测序工作深入开展的过程中, 基因序列数据库已有一定程度的积累，并随着基因测序技术的不断完善，以很高的速度不断充实。然而这些序列数据大多缺乏明确的功能注释(Napoli等，1990)。目前，双子叶模式植物拟南芥（The institute for Genomic Research : http :/ / www. tigr. org）和单子叶模式植物水稻（Yu 等，2002；Goff 等，2002；Hsing 等，2005）测序工作已经完成。植物基因组学的重心已开始由结构基因组学转向功能基因组学，随着后基因组的到来，加速基因功能的确定已成为当务之急（刘敏等，2002）。RNA干涉技术自从被发现以后，由于其表现出的许多独特的优点迅速地成为植物功能基因组学研究的重要手段，得到学术界的高度重视。目前，利用RNA干涉技术特异性抑制生物体目标基因的表达，以获得目标基因功能缺失突变体，从而进行基因功能分析，是功能基因组学的重要内容。RNA干涉较为普遍的做法是由强启动子启动一段由内含子分隔开的分别以正反两个方向插入的目标基因序列，该序列应是目标基因开放阅读框（ORF）的一部分。根据RNA干涉的原理，其转录出来的mRNA会形成以内含子为环，以目标基因片段为臂的发夹结构（hairpin）。该发夹结构中的dsRNA将会介导目标基因mRNA的降解，从而实现目标基因表达的抑制。据报道，98853bp长度的正反义臂构成的发夹结构均能有效实现目标基因的沉默（Wesley 等，2001）。目前，CAMTA (Complete Arabidopsis transcriptiome microarray) 计划已开始实施以获得覆盖拟南芥全基因组的高质量的基因序列标签(gene sequence tag ,GST)（Crowe , Serizet 等，2003），为了分析CATMA 中每一个GST 的功能, Helliwell 及同事利用Invitrogen 公司的Gateway 重组克隆技术代替传统费时的克隆步骤，构建高通量基因沉默的载体系列pHELLSGATE（Crowe, Grossniklaus 等，2003），用以构建包括全部拟南芥基因组ihpRNA 转基因系。利用这种思路，澳大利亚的CSIR0 公司也构建出多种适用于禾本科植物的RNAi 载体pHannibal 和pKannibal 质粒载体系列（Wesley 等，2001）。所有的这些都为RNA干涉技术的应用和推广提供了极大的便利。作为高通量的植物功能基因组学研究工具，RNA干涉技术也同时在其广泛的应用中日益变得完善(Miki 等,2004；Miki 等,2005；Travella 等，2006；Mansoor 等，2006；Elio 等，2007；Ballachanda 等，2007；Chen 等，2008)。2.4 RNAi技术应用的问题与展望尽管许多研究表明RNAi能特异而有效地沉默目标基因，显著降低其表达量（Xiao 等，2003；Miki 等，2004；Wang 等，2004）。然而，RNA干涉仍然存在许多尚未解决的问题，例如：（1）目前RNAi机制尚未被完全阐明；（2）由于细胞内的RNA酶可能会降解siRNA， siRNA的稳定性问题有待解决；（3）植物体内存在各种各样的自我保护和修复机制，会对RNAi作用产生拮抗作用，使其减弱或消除，从而使RNA干涉达不到预期的效果。（4）RNA干涉的阻断作用虽然是特异性的，但若其目标片段选择不当，也容易因序列的同源性而造成其他非目标基因不同程度的沉默，导致表型混淆，不利于目标基因的功能分析。作为一种新兴的反向遗传学方法，RNA干涉技术与其他反向遗传学方法相比，具有系统性、高效性、特异性、时空表达可调控性等特点。随着植物功能基因组时代的到来，RNA干涉将作为高通量的植物基因组研究工具，发挥其应有的巨大作用。随着RNAi技术在应用过程中的不断完善，质粒载体系列资源越来越丰富，再加上转基因技术的广泛应用和不断成熟，RNAi技术将变得越来越简单、便捷、高效，将极大地推动植物科学研究快速地朝纵深方向发展。3 植物磷转运蛋白基因表达调控和功能研究现状 3.1 植物适应土壤磷缺乏的适应机制磷是植物生长发育不可缺少的大量营养元素之一。它参与植物体内核酸、磷脂、ATP等重要物质的合成，调控植物体内多种代谢过程，并作为能量转移物质，直接参与能量代谢（Marschner等，1995）。植物对土壤中磷素的吸收主要以无机磷（Pi）的形式进行。由于磷很容易与钙、铁、铝等很多金属元素形成难溶性化合物，在自然状态下,土壤中可溶性磷的浓度很少超过10 M（Ozanne等，1980），自然状态下土壤可溶性磷浓度低下一直是农作物产量的重要限制因子，耕作状态下常需要通过施用磷肥来维持作物的正常生长和较高的产量。然而，磷肥的过度使用会导致进入土壤中的磷在固相表面的吸附和与金属元素形成难溶性化合物而加以积累，最后成为土壤中无效的“天然磷库”，同时，磷肥的淋失也可导致周边水体中磷的富营养化，导致一系列的环境问题。因此，研究作物对磷营养的吸收规律，改善作物对磷的吸收和利用，对磷肥的科学施用，有效提高农作物产量有重大的指导意义。植物自身对低磷条件的适应性变化包括分泌酸性磷酸酶(Apase)和有机酸，改变根系形态、结构，形成菌根等机制来提高土壤中磷素的有效性（廖红等，2000；Miller等，1998；李玉京等，1998；李玉京等，1999；Johason 等，1996；Fernandes 等，1994；Wasaki 等，2003；Harrison 等，1999；Smith 等，2002）。然而，不管是根际中的有效磷还是从互生菌根中吸收的菌丝体所富集的磷，它们最终都需要通过植物根系高效的吸收和转运系统磷素截获转运蛋白，来吸收利用。无机磷通过根细胞膜进入植物体内是由同一或不同家族的多个磷素转运蛋白调控的。磷素转运蛋白依据介质中有效磷浓度的高低，可分为低亲和力(Low Affinity)和高亲和力(High Affinity) 两大类。一般认为，低亲和力磷转运蛋白只能将细胞外高浓度的有效磷转运到细胞内，是磷素供应充足条件下植物吸收和转运磷的系统，主要为组成型表达；而高亲和力磷转运蛋白可以将低浓度的胞外有效磷转运到胞内，担负着缺磷条件下根系吸磷重任，因此备受研究人员的关注，其表达主要受磷营养胁迫诱导（Lefebvre 等，1982；杨存义等，2006；王萍等，2006）。3.2 植物磷酸盐转运蛋白的研究现状依据系统进化分析结果，目前已知的磷转运子可分为Pht1、Pht2、Pht3、Pho1和Pho2五大家族。其中Pht1主要位于根系细胞膜上，与植物对土壤溶液可溶性磷的吸收关系密切（杨存义等，2006）。Pht1家族基因因其对土壤磷吸收的重要意义而成为研究的热点。近年来，研究人员在许多高等植物中，如拟南芥（Muchhal 等，1996；Smith 等，1997；Okumura 等，1998）、苜蓿（Liu，Trieu 等，1998；Javot 等，2007）、水稻（Paszkowski 等，2002；Ming 等2005）、小麦（Davies 等，2002）、大麦（Rae 等，2003）、番茄（Liu，Muchhal 等，1998；Nagy 等，2005；Xu 等，2005）、马铃薯（Leggewie 等，1997）、玉米（Nagy 等，2006）、茄子（Chen 等，2006）等都克隆到数目不等的Pht1家族磷转运蛋白基因。进一步分析研究表明，该家族基因具有MFS超级家族结构（Persson 等，2003），为H+/H2PO4-共转运子，大多数成员具有高亲合磷转运蛋白特征（Mudge 等，2002；Persson 等，2003）。Pht1家族基因主要在植株根系表达（Mudge 等，2002；Paszkowski 等，2002；Karthikeyan 等，2002），而且大部分成员受磷胁迫诱导表达（Liu，Muchhal 等，1998；Paszkowski 等，2002；Muchhal 等，1996；Davies 等，2002；Rae 等，2003；Leggewie 等，1997；Pattison-Granberg 等，2000；Motoshi 等，2002）。Dong 等推测缺磷诱导表达或增强表达的磷酸盐转运蛋白基因可能是植物适应低磷胁迫的一种机制（Dong等，1999）。此后，又有研究显示，磷高效品种水稻具有在低磷胁迫条件下高效表达磷酸盐转运蛋白的功能（明凤等，2002），说明低磷胁迫条件下磷酸盐转运蛋白的高效表达可能是植物适应低磷胁迫的遗传本质。3.3 水稻磷转运蛋白研究现状已经报道水稻整个基因组含有13个Pht1家族的成员，其中有10个在根部表达，其中OsPT11被证明是受菌根特异诱导表达（Goff 等2002；Paszkowski 等，2002），OsPT13被证明受菌根诱导增强表达（Glassop 等，2007），而其转运体对磷素的吸收转运、在水稻体内的生理功能及其受菌根调控的机制仍不清楚。明凤等研究发现，OrPT1基因的超量表达能缓解低磷胁迫对低磷敏感型水稻品种愈伤的生长抑制，证实了OrPT1基因确实可以增强愈伤组织在磷胁迫条件下的吸磷能力（明凤等，2004）。目前，研究者从拟南芥、马铃薯、苜蓿、番茄、蔷薇等植物中都分离出了可以互补高亲合力磷转运缺失酵母突变体的磷转运蛋白（Muchhal 等，1996；Leggewie 等，1997；Daram 等，1998；Kai 等，1997），明凤等在水稻中克隆的OsPT6:1也被证明可以互补酵母高亲合力磷转运缺失突变体（明凤等，2006），郭强等的研究表明OsPT6蛋白由12个亲脂的跨膜区组成，与MFS超级家族的酵母磷转运蛋白基因PHO84具有较高的相似性，是H+/H2PO4-共转运体，在酵母吸收动力学中表现出较低的Km值（96M），可能是一个高亲和的磷转运蛋白（郭强等，2008）。此外，关于水稻磷转运蛋白基因生理功能分析研究工作几乎未见报道。61第二部分 研究思路与材料方法第二部分 研究思路与材料方法1 研究思路已经报道水稻整个基因组含有13个Pht1家族的成员，有10个在根部表达，其中就包括OsPT2和OsPT6。而且，OsPT2和OsPT6受缺磷诱导增强表达（Paszkowski 等，2002），可以预测OsPT2和OsPT6在磷胁迫条件下水稻对磷营养吸收方面的重要作用。本研究的焦点将集中在水稻磷转运蛋白基因OsPT2和OsPT6的生理功能分析上。计划通过RNAi的方法获得OsPT2和OsPT6基因沉默突变体，并以之为研究材料进行与磷转运相关的表型分析，从而验证目标基因的生理功能。1.1 实验流程设计实验流程简图：目标基因片段选择RNAi表达载体构建GUS染色筛选农杆菌愈伤诱导继代侵染共培养第一轮筛选第二轮筛选分化生根炼苗繁种沉默效果检测目标基因生理功能分析图2-1 实验流程简图Fig.2-1 Flow chart of experiment1.2 主要研究内容1.2.1 目标基因沉默效果通过RT-PCR的方法检测不同株系目标基因的沉默效果，从中选取沉默效果显著的株系作为突变体材料进行目标基因生理功能分析。1.2.2 目标基因沉默对水稻植株生物量和吸磷总量的影响通过对突变体材料植株生物量和植株吸磷总量指标的测定分析，探讨目标基因在维持植株正常生物量和吸磷能力方面的功能。1.2.3 目标基因沉默对水稻根系形态的影响通过对沉默突变体材料总根长、根系总表面积、根系体积和根尖数等指标的统计分析，探讨目标基因的表达与水稻根系形态之间的相关关系。1.2.4 目标基因沉默对同家族其他磷转运蛋白成员表达状况的影响通过定量PCR方法检测同家族其他磷转运蛋白基因的表达