外周血循环RNA、微小RNA与肿瘤诊断.doc

外周血循环RNA、微小RNA与肿瘤诊断外周血循环RNA、微小RNA与肿瘤诊断循环核酸(circulating nucleic acid,CNA)是指存在于血液(血清或血浆)等体液中的细胞外游离DNA和RNA,与生理和病理状态下的细胞代谢密切相关,循环DNA和RNA水平的检测及其在基因诊断等方面的应用对于恶性肿瘤等疾病的诊断和监测具有十分重要的意义。近期人们在进行循环DNA、RNA分子检测的同时,在循环微小RNA(microRNA,miRNA)方面也做了许多的工作,研究结果使得与肿瘤相关的核酸分子检测这一领域变的更加让人振奋。在血液中检出肿瘤特异性的miRNA并将其作为肿瘤的生物学标志对于早期诊断肿瘤具有至关重要的意义。生物技术的发展日新月异,肿瘤的早期诊断、预后监测及跟踪随访等越来越受益于肿瘤分子标志物的发现及其检测方法的完善。由于利用手术切除的肿瘤标本进行分子生物学等方面的检测存在一定的局限性,如标本来源的限制、无法连续检测及随访等,因此肿瘤患者外周血循环核酸(circulating nucleic acid,CNA)分子的检测成为医学工作者关注的热点。近期人们在进行循环DNA、RNA分子检测的同时,在循环微小RNA(m icroRNA,m iRNA)方面也做了许多的工作,研究结果使得与肿瘤相关的核酸分子检测这一领域变的更加让人振奋。由于外周血循环DNA方面的综述性文章较多,本文就循环RNA及miRNA近年来的研究进展作简要综述。1肿瘤循环RNA的来源及生物学特性循环核酸是指存在于血液(血清或血浆)、滑膜液等体液中的细胞外游离DNA和RNA。早在20世纪70年代末,人们就发现肿瘤患者血清DNA含量增加1。20世纪80年代的零星研究发现,淋巴细胞或多种肿瘤细胞能够自发分泌含有RNA的蛋白质/脂类复合体2,3;Wieczorek等4也于1987年从多种恶性肿瘤患者血清中发现RNA2脂蛋白复合体。但由于RNA分子极不稳定,且血液中存在含量丰富的核糖核酸酶(ribonuclease,RNase),外周血中存在循环RNA这一说法很难被人们所接受。直到20世纪末,从Kopreski等5检测恶性黑色素瘤患者血清酪氨酸酶(tyrosinase)mRNA开始,研究者们相继从鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、滤泡性淋巴瘤患者的血清/血浆中发现肿瘤相关RNA的存在,如端粒酶成份(telomerase components)RNA6,7、不同肿瘤相关基因编码的mRNA812和病毒RNA13等,循环RNA这一观点才开始被人们所接受。循环核酸的来源目前尚不十分清楚,与循环DNA来源的研究相比,循环RNA来源的文献报道很少,一般认为正常人血清/血浆中微量的循环RNA来源于自身的淋巴细胞,而恶性肿瘤患者的循环RNA则大多数来源于肿瘤细胞。肿瘤转移过程中,脱落的肿瘤细胞在血液循环中凋亡,或被机体免疫系统识别后消灭,会有核酸释放入血,而原发灶肿瘤生长代谢过程中也会不断因细胞坏死释放核酸入血,导致循环RNA的浓度升高。由于血液中存在含量丰富的RNase,且肿瘤患者外周血中RNase的活性升高已有实验证实,不论是长链或是短链RNA分子都十分容易降解,研究者们围绕循环RNA的稳定性进行了更为深入的研究。Ng等14在提取循环RNA之前,血浆样本经不同孔径的过滤器过滤或超速离心后,分别检测了32磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA、2球蛋白基因DNA,发现经0.22m孔径过滤器过滤和超速离心后,健康人血浆GAPDH mRNA水平与相应的未离心样本比较平均降低15倍,肝细胞癌患者血浆GAPDH mRNA水平平均降低了9.3倍,而经不同孔径过滤的血浆样本2球蛋白DNA浓度则无明显差异,表明血浆RNA可能以有关粒子的形式存在而得到保护,而循环DNA是由不同的机制释放,或含有DNA的微粒因某种原因被破坏。目前研究显示,外周血中循环RNA可能与包括核蛋白2、脂类3、脂蛋白4、糖蛋白15、p53蛋白16等多种物质形成复合体或包含于凋亡小体12,17、合胞体滋养层微粒18而免受RNase的降解,而大部分RNA单体被降解14。此外,Stroun等2认为细胞外RNA还可以通过与DNA形成杂交体而免受RNase的降解。Halicka等19证实肿瘤患者,尤其是正在接受治疗或治疗后的患者,体内确实存在含有不同DNA或RNA的凋亡小体,在肿瘤细胞凋亡过程中,DNA及RNA包装于不同的凋亡小体释放入血。2肿瘤循环RNA临床应用的研究先前的研究指出循环DNA具有和肿瘤相一致的变化,如DNA链的稳定性下降、Ras和p53基因的突变、微卫星改变、肿瘤抑制基因启动子的异常甲基化、编码免疫球蛋白重链DNA的重排、线粒体DNA的突变以及和肿瘤相关的病毒DNA20。最近,人们发现循环RNA也存在和肿瘤相一致的变化,并且研究人员已利用这些变化做了一些临床方面的研究,其中主要包括以下几个方面。2.1酪氨酸酶m RNA酪氨酸酶被证明是恶性黑色素瘤的标记分子,Koreski等5通过实验指出,在6例恶性黑色素瘤患者的血浆中,其中有4例可以检测到肿瘤来源的酪氨酸酶mRNA;而在20例健康对照个体中没有1例可以检测到肿瘤来源的酪氨酸酶mRNA。随后,两个研究小组进一步评价了血浆或血清酪氨酸酶mRNA作为恶性黑色素瘤分子标志的应用价值12,21。此外,Hasselmann等12表明血浆酪氨酸酶mRNA阳性与恶性黑色素瘤临床分期关系最为密切,期患者检出率可达50%80%,治疗后酪氨酸酶mRNA阳性转阴的患者其生存期明显延长,提示酪氨酸酶mRNA可作为评价治疗效果和预后的指标。2.2端粒酶成份端粒是真核细胞线性染色体末端的一种特殊的异质化结构,其功能是维持染色体的相对稳定,参与染色体在核内的定位和基因的表达调控,决定细胞的分裂增殖能力及生存期限。由于DNA聚合酶不能从头合成DNA,须由RNA引物起始,因此当引物降解后新合成的DNA链便留下一段无法填补的缺隙,使染色体随着复制而变短,直至完全丧失复制能力,这就形成了所谓的“末端复制问题”。1985年,Greider和Blackburn从四膜虫细胞提取物中发现了端粒酶的存在。端粒酶是一种特殊的逆转录酶,其能利用32端粒作为引物,以自身RNA组分为模板来逆转录合成端粒DNA序列,并不断添加到染色体末端,维持端粒长度的稳定,从而解决了“末端复制问题”。人类端粒酶由两部分组成:端粒酶RNA模板(telomerase RNA,hTR)及端粒酶逆转录酶(telomerasereverse transcrip tase,hTERT)。大量的研究表明,端粒酶活性异常在几乎所有的癌症患者中被发现,正常组织和良性肿瘤的端粒酶检出率为1%4%,而各种恶性肿瘤组织的端粒酶检出率高达84%95%。近年来,端粒酶成份的检测已不仅仅局限于活检组织或切除标本,诸如血液等标本也得到了广泛的应用,并取得了满意的结果。Chen等6采用RT2PCR定性检测了18例乳腺癌患者、2例良性乳腺疾病患者及21例健康人血清hTR和hTERT的表达水平,结果28%(5/18)的肿瘤患者血清hTR阳性,25%(4/16)的肿瘤患者血清hTERT阳性,而2例良性乳腺疾病患者及21例健康人的血清均未检出hTR和hTERT。随后,Miura等22发现正常人血清无hTERT的表达,而慢性肝炎、肝硬化患者血清hTERT阳性率分别达到42%、70%,78例肝细胞癌患者血清hTERT阳性率竟高达89.7%。Dasi等7首次应用实时定量RT2PCR检测了9例结直肠癌患者、9例滤泡淋巴瘤患者和10例健康志愿者的血浆hTERT表达水平,结果发现:血浆hTERT平均值结直肠癌病人(18.974.91)和滤泡淋巴瘤病人(26.275.81)均明显高于健康志愿者(2.710.41,P0.005),但血浆hTERT值与肿瘤分期无明显相关23。将健康人群中的最高浓度赋值为阳性临界值(4.82),研究者发现9例结直肠癌患者中有8例为阳性,9例滤泡淋巴瘤患者全为阳性。同样是Dasi的研究组,以前列腺炎患者及健康人分别作为疾病对照与正常对照,研究者们发现前列腺癌患者血浆hTERT表达水平远高于对照组;当把临界值赋为0.35时,检测的灵敏度与特异性分别能够达到81%和60%,与前列腺特异性抗原(prostate specific antigen;prostate2specific antigen,PSA)联合检测能够早期诊断前列腺癌24。Miura等25也在前期定性研究的基础上,对hTERT mRNA进行了定量分析,发现hTERT在肝细胞癌患者血清中的表达水平远高于其在肝硬化和慢性肝炎患者血清中的表达水平。实时RT2PCR检测血浆hTERT mRNA操作简便、可定量,具有广阔的应用前景。2.3不同肿瘤相关基因编码的m RNA不同肿瘤相关基因编码的mRNA检测是目前循环RNA领域研究最多最深入的,如乳腺癌患者M ammaglobin、CK19 mRNA的检测,结直肠癌患者CK19、CK20、CEA mRNA的检测,肝细胞癌患者GAPDH mRNA的检测,肺癌患者hnRNP2B1及Her2/neu mRNA的检测。2.3.1乳腺癌乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,在发达国家其发病率位于女性恶性肿瘤之首,病死率仅次于肺癌,居第2位。Gal等10研究表明,60%(6/10)的乳腺癌患者乳珠蛋白(mammaglobin)mRNA阳性。Silva等8随后进一步扩大样本量后证实,60%(27/45)的乳腺癌患者mammaglobin mRNA阳性,49%(22/45)细胞角蛋白(CK)19 mRNA阳性,均显著高于其在正常对照组中的阳性率(l2%和20%),而且肿瘤大小和增生指数与mammaglobin和/或CK19 mRNA阳性显著相关。2.3.2结直肠癌结直肠癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤。每年全世界约有50万人发病,在西方居恶性肿瘤死亡率第三位;在我国年死亡率达5.30/10万,居恶性肿瘤死因第五位。早期诊断及发现转移病灶对于治疗及判断患者预后有着重要意义。CK20是具有良好特异性的胃肠道肿瘤标志,Funaki等26的研究显示,结直肠癌患者血浆CK20 mRNA阳性与肿瘤分期密切相关,期患者阳性率可达70%,而对照组无一例阳性,因此可将血浆CK20 mRNA作为肿瘤转移的特异性标志。此外,血浆CK20 mRNA阳性患者存活率明显低于阴性患者,提示血浆CK20 mRNA对判断预后也有一定价值。Silva等27随后用巢式PCR检测了53例结肠癌患者及25例健康对照者血浆CK19和CEA mRNA阳性率。在对照组中,分别有4%(1/25)CEA mRNA阳性,20%(5/25)CK19 mRNA阳性;而32%(17/53)患者CEA mRNA阳性,73.6%(39/53)患者CK19 mRNA阳性,疾病组与对照组比较有统计学意义,且患者血浆CK19及CEA mRNA阳性与肿瘤分期密切相关,晚期结肠癌患者有更高的阳性率。此外,血浆2连环蛋白(catenin)mRNA表达水平不仅与结直肠癌肿瘤发生、分期相关,对判断患者预后也有一定价值28。2.3.3肝细胞癌据统计,目前全球每年新患原发性肝癌(hepatoce1lular carcinoma,HCC)患者约为626 000,其中55%发生在我国。我国每年约110 000人死于HCC,肝癌诊治形势十分严峻。Ng等14发现,HCC病人血浆GAPDH mRNA表达水平明显高于健康对照组,尽管病人组的低值和对照组的高值有部分重叠,但大多数病人可以通过血浆GAPDH mRNA定量检测予以鉴别。2.3.4肺癌肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的生命与健康。目前随着肿瘤分子生物学的发展,对肺癌分子水平的逐步深人,肺癌患者外周血循环RNA的表达水平已成为众多科研工作者们普遍关注的问题。Fleischhacker等11检测了18例肺癌患者血清hnRNP2B1及Her2/neu mRNA水平,发现分别有14例及7例阳性;联合检测hnRNP2B1及Her2/neu mRNA,可检测出全部的恶性肺癌患者。此外,血清5T4 mRNA阳性对肺癌检出也有较高的特异性9。迄今为止,虽然肿瘤相关RNA释放入外周血形成循环RNA及其在血液中的存在形式尚未完全清楚,循环RNA检测目前也并不能直接用于肿瘤的早期诊断和疗效判断,但它可提供肿瘤负荷及治疗疗效方面的信息,其在临床上的应用价值正在逐步被人们所了解。因此,对外周血循环RNA的检测,将有可能成为颇有前景的检测手段,并且有可能在肿瘤的检测方面使无创伤检测成为一种可能。然而,肿瘤的发生、发展往往是多基因联合作用的结果,若只检测某一种或几种肿瘤相关基因编码的mRNA,其灵敏度与特异性往往有限,把其作为肿瘤的早期诊断标准还远远不够。Li等29首次将基因表达谱分析用于血清循环RNA的检测。研究者比较了口腔癌患者及正常人血清mRNA表达谱,发现了325种差异表达的转录产物,检测的敏感性及特异性分别达到91%和71%,使得与肿瘤相关的循环RNA检测这一领域变的更加让人期待。3肿瘤循环m iRNA的研究微小RNA(microRNA,miRNA)是一些5端带磷酸基团、3端带羟基的,长度为二十几个核苷酸的非编码调控RNA家族30。迄今在人类、动植物等物种中已有八千余种miRNAs被发现,通过调控基因表达来参与生命过程中的一系列重要进程,包括早期发育、细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡(MiRBase http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/)。许多病毒也会与宿主的m iRNA s相互作用,并且相当一部分病毒还能编码自己的miRNAs,调控自身蛋白的表达或者钝化宿主本身的防御系统31,32。近年不断涌现对miRNA进行高通量检测的相关技术,比如miRNA芯片33、磁珠流式细胞m iRNA表达谱检测34、定量RT2PCR35等,通过癌组织及癌旁正常组织的横向比较找出癌组织中特异表达的m iRNA s,并对各期进行纵向比较,找出肿瘤各期差异的m iRNA s,从而完成对肿瘤的诊断和分期36,37。然而,由于肿瘤标本来源的限制,使得其在临床上的应用可能存在一定局限性。外周血的获得越来越简便,能在血液中检出癌症特异性的miRNA并将其作为癌症的生物学标志对于早期诊断癌症具有至关重要的意义。这一新兴的研究领域在测定血清miRNA上开始得到应用。第一个被发现的循环miRNA是血清中的miR221。Lawrie等38证实,弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的血清m iR221水平很高,且与好转的不复发存活率密切相关。大约在同一时间,Mitchell等39将人前列腺癌细胞输入作为异种移植物模型的小鼠体内,证明了血清/血浆中含有稳定水平的肿瘤来源的miRNA,进一步的研究发现,在转移性前列腺癌患者的血清中,miR2141高度过表达,用miR2141表达水平来区分前列腺癌患者与正常人,敏感性与特异性能够分别达到60%和100%。此外,miR2184在人舌鳞状细胞癌患者血浆中高水平表达,其在术后患者血浆中的表达水平显著下调,是人舌鳞状细胞癌诊断及手术疗效监测较好的标志物40。随后,研究者们相继通过表达谱芯片或实时定量RT2PCR的方法系统探讨了血浆循环miRNA作为早期诊断肝损伤、结直肠癌、肺癌、糖尿病等疾病的可能性。Wang等41利用过量扑热息痛(acetaminophen)诱发小鼠产生肝损伤,采用包含576种miRNAs的Agilent芯片检测肝损伤小鼠及正常对照小鼠的肝组织及血浆m iRNA的表达水平,发现正常及损伤性肝组织中分别存在23种和40种miRNAs,其中8种miRNAs在正常及损伤性肝组织中都有表达;正常及肝损伤小鼠血浆中分别存在43种和53种miRNAs,其中29种miRNAs在两种血浆中都有表达。进一步的研究发现,扑热息痛的剂量也会影响肝组织及血浆miRNA表达谱,分别有51种和44种miRNA发生变化,其中20种在肝组织及血浆中的表达都有所变化。然而,令研究者不解的是,20种中的17种miRNA其变化趋势是相反的。如m iR2122、m iR2192在肝损伤小鼠的血浆里表达上调,而在损伤性肝组织里表达下调;miR2710、miR2711在损伤性肝组织中表达上调,在血浆里面表达却是下调。此外,血浆miR222、miR2101b、miR2122、miR2133a、miR21353、m iR2192、m iR2193、m iR2486与丙氨酸转氨酶都能够反映肝损伤程度,令人惊奇的是,miR2122和miR2192比目前临床应用的肝损伤指标丙氨酸转氨酶能更敏感、更早地反映肝损伤及损伤程度。Ng等42就血浆中95种miRNAs表达水平与结直肠癌的发生进行了比较系统地探讨。研究者首先采用实时定量RT2PCR的方法分别检测了5例结直肠癌患者及5例健康人血浆中95种miRNAs的表达情况,同时检测了患者癌组织及癌旁正常组织的miRNA的表达情况,发现有5种miRNAs(miR21723p,miR2135b,miR2222,m iR292和m iR295)在患者的癌组织及血浆中的表达显著性上调。随后,通过检测上述5种miRNAs在25例结直肠癌患者和20例健康人血浆中的表达情况,发现miR21723p和miR292在患者血浆中显著性过度表达,且这2种miRNAs在另10例术后结直肠癌患者血浆中的表达水平较患者术前显著性下调。最后,研究者们检测了miR21723p和miR292在90例结直肠癌患者、20例胃癌患者、20例炎性肠病患者和50例健康人血浆中的表达水平,发现miR292在结直肠癌患者血浆中的表达水平显著高于其它三组,受试者操作特征性曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)面积能够达到88.5%,敏感性及特异性分别能够达到89%和70%。有趣的是,并没有检测到miR292在晚期结直肠癌患者血浆中过度性表达,提示血浆miR292可以作为早期结直肠癌的诊断性标志物。国内学者在外周血循环miRNA方面的研究也走在了世界前列。Cell Research 2008年9月2日在线出版了中国南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室、江苏省糖尿病中心张辰宇研究组的原创性论文“Characterization ofmicroRNAs in serum:a novel classof biomarkers for diagnosis of cancer and otherdiseases”43,迅速引起国际媒体的广泛关注,据不完全统计,全球已有300多家网络媒体转载报道了这一来自中国的最新研究进展。研究组采用单分子微阵列(solexa)技术,对健康中国人的血清所有m iRNA进行测序,分别在男性和女性中发现了超过100种和91种血清miRNAs。此外,肺癌、结直肠癌和糖尿病患者血清中的miRNA存在疾病特异性表达谱,肺癌患者的血清中有63种miRNAs是健康人血清中所不存在的,有10种m iRNA s是肺癌和结直肠癌各自特异的,血清m iRNA指纹同样能很好地诊断结直肠癌,这为血清m iRNA中有识别疾病的指纹提供了证据。有趣的是,研究者们还发现肺癌患者血清和血细胞中的miRNA表达谱是不同的,而在健康人,这两者则完全一致。此外,采用Solexa技术和实时定量RT2PCR技术相结合,在75名健康志愿者和152例肺小细胞肺癌患者中进行的独立验证研究中,研究者还证实了2种非小细胞肺癌特异性的miRNAs(miR225和miR2223)。该研究发现的疾病特异性miRNA表达谱可作为一类新的血清生物标志物,为肿瘤等疾病的早期诊断提供了一种敏感、特异、简单的临床诊断技术。该技术还可用于肿瘤分类、预后及疗效预测、手术疗效监测及疾病复发预测等领域。这一最新研究进展为癌症及其它疾病的诊断提供了一种新的非损伤性的诊断方法并可能带来未来临床医学上的变革。4问题与展望肿瘤分子生物学的研究进展,为分析和最终阐明肿瘤的发生、发展开辟了新的天地。循环核酸作为一个新兴的研究领域,许多方法和技术尚处于探索阶段,与循环DNA的研究相比,循环RNA、miRNA的研究更是少之又少。综上所述,循环RNA、miRNA的研究对象多集中于恶性肿瘤,在母体血浆中检测循环RNA、m iRNA方面也开始有少量报道4451。作为一种非侵入性的早期检测手段,能在许多领域广泛地应用,目前的研究中已显示出了良好的发展前景,但仍有许多问题需要科研工作者们思考、解决。(1)循环RNA、m iRNA究竟是怎样进入血清、血浆或其它体液的?是一个主动过程还是一个被动过程?(2)由于血液中存在含量丰富的RNase,不论是长链或是短链RNA分子都十分容易降解,循环RNA、miRNA真正以什么样的形式在体液中循环?循环RNA、miRNA为什么不受RNase的破坏?m iRNA是非编码调控RNA家族中的一员,人们可能自然会联想到循环miRNA可能也以上述的脂蛋白、凋亡小体等形式存在。最近的研究表明,循环mRNA、miRNA很可能来源于机体多种组织及多种类型的细胞,包装于外染色体(exosome)或经过转录后修饰释放入血,从而免受RNase的降解5255。有趣的是,Valadi等54表示某些mR