pbs精确配方1.doc

这是本人精心总结出来的0.1M PBS：1000ml蒸馏水中加NaCl 9g Na2HPO4.12H2O 6g NaH2PO4 .2H2O 0.4gPH：7.2为博士德配方分子克隆上的PBS配方：NaCl: 8.00gKCl: 0.20gNa2HPO4*H2O: 1.56gKH2PO4: 0.20g1. 0.01mPBS (PH7.4)Na2HPO412H2O（磷酸氢二钠） 3.473gNaH2PO412H2O（磷酸二氢钠） 0.226gNacl 0.9g三蒸水 1000ml2. 加氯化钠的称PBS，加氯化钾、氯化钠的称KPBS。不加氯化钠、氯化钾的称PB。关于缓冲溶液PB的配制，好多参考书如生物技术实验的后面均附有缓冲溶液的配制配方，可以根据需要配制PH5.78.0的PB缓冲溶液。S就是指氯化钠的含量，一般为0.85，即是100ml里面加0.85克，这个时候的PBS的浓度是0.1M的。一般在免疫组化洗涤中采用0.01M的PBS，pH7.07.4。我们在实验中直接将0.1M的稀释十倍，即可。最好能现配现用。母液4可以保持12周，影响不大。0.01M PBS （PH 7.2）（g/ L）NaCl 8.0KCl 0.2KH2PO4 0.2Na2HPO4.12H2O 2.9用1N的NaOH调节PH 值至7.2ddH2O定容至1000ml，高压灭菌0.01PBS液：NaH2PO4.2H2O 0.5gNa2HPO4.12H2O 5.9gNaCl 9g加双蒸水至1000ml差不多刚好pH7.4PBS的配制称取NaCl 8.00g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g Na2HPO4H2O 1.56g，加入蒸馏水至总体积为1000ml，溶解后过滤除菌待用。0.01mol/L，pH7.4的PBS0.2mol/L Na2HPO4 81ml0.2mol/L NaH2PO4 19ml氯化钠 17g蒸馏水加到 2000ml其实道理是一样。0.1M的PB（不加氯化钠）配方：1.储备A液，磷酸氢二钠35.6克，加重蒸水溶解至1000ml。储备B液，磷酸二氢钠13.8克，加重蒸水溶解至500ml。2.工作液（0.1M），PH A液（ml） B液（ml） 重蒸水（ml）7.0 30.5 19.5 507.4 40.5 9.5 508.0 47.35 2.65 50 0.1M的PBS配方：储备A液： 1M的氯化钠溶液（氯化钠5.844克，加重蒸水至100ml ）储备B液：0.2M磷酸氢二钠（Na2HPO4 5.678克加重蒸水至200ml 或Na2HPO412H2O14.32克加重蒸水至200ml ；储备C液：0.2M 的磷酸二氢纳（NaH2PO4）2.76克加水至100ml或（NaH2PO412H2O）3.12克加重蒸水至100ml；工作液：A液 12.5ml 62.5ml 12.5mlB液 8.1ml 40.5ml 81mlC液 1.9ml 9.5ml 19ml加重蒸水至 100ml 500ml 1000ml（在工作液中 磷酸缓冲液浓度为0.1M,L氯化钠浓度为0.125M,PH为7.37.4，于4度冰箱中克保存三月）我纯化蛋白用的PBS：1.37 mM 的 NaCl 8g，2.7 mM的 KCl 0.2g，10 mM 的 Na2HPO412H2O 3.58g，2 mM的KH2PO4 0.27g，然后加NaOH用PH计调PH值8.0。从美国来的配方，我们实验室一直用的这个，很好使的！我们科在临床上做了很多免疫组化，结果很漂亮。是工作浓度，根据自己的要求配浓缩液Na2HPO412H2O（磷酸氢二钠） 13.42gNaH2PO42H2O（磷酸二氢钠） 1.95gNacl 42.5g三蒸水 5000ml关键是pH，一定要调在7.4左右，其实配方都差不多，关键是pH。可以用NaOH和盐酸调。(1)0.2M Na2HPO4: Na2HPO412H2O 71.64g加蒸馏水至1000ml;(2)0.2M NaH2PO4: NaH2PO42H2O 35.6g加蒸馏水至1000ml。按81.0ml(1)+19.0ml(2)比例，再加17gNaCl和1900ml蒸馏水，即为0.01MPBS 加入蒸馏水时不要全部加完，最后剩余100ml不要加，用NaOH或Hcl调节pH之后，再将蒸馏水补足。“0.01M到底是指的什么？”指的是H2PO4或HPO4的浓度。0.2M的H2PO4或HPO4取100ml，稀释20倍成2000ml。此时的浓度为0.2/20=0.01M。一般免疫组化用PBS都只包含Na2HPO412H2O（磷酸氢二钠） NaH2PO42H2O（磷酸二氢钠）Nacl 用于细胞培养的PBS需含有氯化钾我们实验室的配方：A液：0.1mol/L磷酸二氢钾：磷酸二氢钾（KH2PO4，MW136.09）1.361g，加双蒸水至100ml。B液：0.11mol/L磷酸氢二钠：酸酸氢二钠（Na2HPO4.2H2O，MW177.99）1.78g，加双蒸水至100ml。或者酸酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O，MW358.14）3.58g，加双蒸水至100ml。pH A液 （ml） B液（ml） 5.60 9.50 0.255.91 9.00 1.006.24 8.00 2.006.47 7.00 3.006.64 6.00 4.006.81 5.00 5.006.98 4.00 6.007.17 3.00 7.007.38 2.00 8.007.73 1.00 9.008.04 0.50 9.50免疫组化操作流程（PAP法、ABC法）1.脱蜡至水：二甲苯（1）、（2）脱蜡各15min无水乙醇（1）、（2）各5min90%乙醇5min水洗PBS5min2.抗原修复：1）微波修复：微波中高档5min 3次自然冷却至室温PBS过一遍3次52）酶消化：0.1%胰蛋白酶37孵育30min PBS5min 3.阻断内源性过氧化物酶：置3% 3次5双氧水浸泡15min PBS5min 4.封闭：10%正常二抗血清室温10min 5.一抗孵育：甩去血清后加一抗，置湿盒内4过夜PBS5min 3次56.二抗孵育：擦片后加二抗，置湿盒内37孵育30minPBS5min 3次57.PAP或SABC孵育：擦片后加PAP或SABC，置湿盒内3730minPBS5min 3次58.显色：DAB-H2O2显色10min左右，镜下控制水洗终止显色9.复染：苏木素复染1min水洗至变蓝1%盐酸乙醇分化水洗至变蓝10.封片：无水乙醇脱水5min 2次二甲苯透明5min5 2次中性树胶封片5注意事项：1)DAB为致癌物，操作时带手套，用专用染色缸染色，染色后将染色用具清洗干净，滤纸和小木棍用后丢弃。2)微波修复时外缸内不能有水，否则容易将染缸煮破。3)所有操作步骤中，均应注意防止干片，以免产生非特异性显色。4)PBS配方： Na2HPO4 37.3g KH2PO4 4.3g 加蒸馏水至10000ml(PBS瓶划蓝线处)NaCl 68g1. 是否每个抗体都要经过抗原修复？我所知道有些抗体不需要经过抗原修复，甚至某些单抗。2. 二抗，置湿盒内37孵育30min,温度太高了，容易产生非特异性显色。只要20孵育30min就行了。3. DAB-H2O2显色也只要3到5分钟足够了。几个问题？1。“10%正常二抗血清“是什么？含2抗的血清？ 还是单纯血清？用5%脱脂奶粉也可以把2“. PAP或SABC孵育：擦片后加PAP或SABC，置湿盒内3730minPBS5min 3次5这一步是干什么的？pap?sabc是什么？我看我的师兄做得没有这一步啊？3。“DAB-H2O2“ 是什么？怎么配？我师兄好像是用蒸馏水来陪dab的4。“脱水“和最后“封片“ ，我们这里用的事梯度酒精70%-100%。作用是不是和搂主单纯用无水酒精一样啊？谢谢1.10%正常二抗血清是指的抗血清,比如你的一抗是兔抗鼠的,那你