甲醇酵母植酸酶的热稳定性.doc

甲醇酵母植酸酶的热稳定性摘 要:对甲醇酵母发酵生产的植酸酶性质和热稳定性进行了研究。实验结果显示该酶活的最佳pH值为pH 5.5,酶液的活性稳定区间为pH 5.0-6.0,当酶液中添加10 mmolCaCl2时,能明显提高植酸酶的热稳定性,在80e保温15 min,其保留酶活可达到原酶液的77.8%。植酸酶液经过多羟基化合物颗粒化处理后,其酶制剂的高温热稳定性比液体酶或普通固体化处理的植酸酶制剂提高50%。关键词:植酸酶;热稳定性;饲料添加剂;颗粒化;多羟基化合物 植酸酶(E.C. phytase)是磷酸酶的一种特殊类型,能够催化植酸(phytate)水解,放出5-6个磷酸基团1,终产物为肌醇(inositol)或肌醇磷酸盐。由于植酸酶蛋白氨基酸顺序中含有Arg-His-Gly模体结构,因此属于组氨酸磷酯酶一类2。植酸酶广泛存在于微生物、植物或动物组织中3,但它的作用在不同的组织中各不相同。在植物中,植酸酶主要为种子萌发提供磷以及为植物提供非常重要的生长因子-肌醇4,此外,植酸盐被水解还能够释放出钾、钙、镁和锌等植物生长所必需的微量元素,肌醇磷酸酯在物质进入细胞的运输系统中也发挥着重要作用,如3-磷酸肌醇在植物运输系统中作为次级信号传递体起信号转导作用5。在微生物细胞中,植酸酶能够对磷的缺乏作出反应,以便及时从周围环境植酸中获得磷供细胞使用。植酸酶在动物细胞中的作用现在还比较模糊,但已知有一个类似于植酸酶的酶(MIPP),它能够调整植酸和1,3,4,5,6-五磷酸肌醇的分子活力6。由于能够水解植酸,解除植酸对营养物质的螯合作用,有效提高食品和饲料的营养价值,同时能够替代饲料中无机磷添加,降低生产成本,减少环境的磷污染,植酸酶已成为一种重要的饲用酶制剂。饲料在加工过程中,一般都要进行颗粒化,以杀灭饲料中的沙门氏菌,改善饲料成分的结构,便于饲料储运,增加禽畜的采食量和营养吸收效率。然而饲料的制粒过程通常是在高温(85-95e)下蒸汽预热,再经过1-2 min的挤压而成。植酸酶作为一种生物活性大分子,对温度、湿度、酸碱度都十分敏感,通常在相对高温下大部分的酶会发生蛋白质变性,导致酶活迅速下降。作为饲料添加剂,有效提高植酸酶的热稳定性具有实际的应用价值和产业化前景。本文对甲醇酵母发酵生产的植酸酶稳定性进行了研究,并用多羟基化合物对其进行颗粒化处理,考察了颗粒酶制剂热稳定性。1 材料和方法111 甲醇酵母植酸酶实验所用的酶液由江西民星集团公司提供。粗酶液经2 500-3 000 r/min离心除杂,分离纯化和超滤膜浓缩处理。112 植酸酶活测定方法酶活测定方法采用目前BASF公司使用的钒钼磷法7。酶活定义为在37e、pH 5.5条件下反应30 min,催化0.005 1 mol/L植酸钠水解,每分钟释放1Lmol的无机磷为一个酶活国际单位(IU)。2 实验结果与讨论211 植酸酶的最适pH值分别取1 mL的酶液加入到不同pH值(1.5-8.5)的乙酸-乙酸钠缓冲液中,在37e条件下保温10 min,然后测酶活,测定结果如图1所示,从图上可以看出,植酸酶的最适pH值位于pH 5.5处,在pH 5.0-6.0间有比较高的活力,当pH值低于4.5或高于6.5时,酶活会急剧下降,在pH 1.5以下或8.5以上酶活接近为零。畜禽胃液的pH值也是5.5左右,正好与植酸酶的最佳pH值相吻合,有利于第27卷第1期2003年3月南昌大学学报(理科版)Journal of Nanchang University(Natural Science)Vol.27 No.1Mar.2003pH图1 pH对植酸酶活性的影响植酸酶发挥最大活力。212 Ca2+对植酸酶热稳定性的影响取三批5 mL酶液试样,分别为原酶液、含10mmolCaCl2酶液和含5 mmolCaCl2酶液,将它们放置于80e下进行高温热处理,每批试样的热处理时间为10-60 min。达到处理时间后取出试样并迅速冷却至常温,然后测定其酶活。80e下含有不同CaCl2浓度酶液的热稳定性和保留酶活随处理时间的变化,如图2所示:t/min图2 高温热处理时间对植酸酶活性的影响从图2可以看出,原酶液在80e高温下不稳定,前20 min内,酶活随时间的增加成直线下降,当处理时间大于20 min时,其相对酶活都低于5%,残留酶活极低。可见,液体植酸酶高温不稳定,不适合在饲料制粒中直接添加,必要进行适当的热稳定性保护处理。当液体酶中加入Ca2+后,在处理的前20 min内,其耐热性明显提高,但提高的程度有所差异。当处理10 min时,加入10 mmolCaCl2的酶液和加入5mmolCaCl2的酶液的保留相对酶活差异不大,皆为80%左右,当处理时间为20 min时,二者差异较大,加入10 mmolCaCl2的酶液的相对酶活为70.1%,仍具有较高的活力,而加入5 mmolCaCl2的酶液的相对酶活为54.8%,明显低于上者。即使随着处理时间的继续增加,加入10 mmolCaCl2的酶液的相对酶活的下降幅度仍低于未加Ca2+的原酶液相对酶活的下降幅度,但是,当时间超过30 min时,加入5mmolCaCl2的酶液的相对酶活则低于原酶液的相对酶活。对于Ca2+能够提高植酸酶的耐热性,韩国学者Yang Mun Choi8从Bacillus sp KHU-10中制取的植酸酶液中加入一定量的Ca2+,在60e下保温10min后其相对酶活为98%,而未加Ca2+的原酶液在同样温度下保温相同时间后相对酶活几乎为零。Nam-Chul Ha9从Bacillus amyloliquefaciens发酵液中分离提取到一种热稳定性植酸酶(TS-phy),这种植酸酶的活性能够被EDTA所抑制,但当加入适量的Ca2+时,活性又能很快恢复,并且热稳定性有了很大的提高。经对植酸酶蛋白质晶体结构分析,发现植酸酶结构形状很像螺旋桨,周围分布有六个叶片,每一个叶片都是一个高度弯曲的薄片,由4-5个联结方式完全相同的反螺旋B-折叠束组成,它的分子内束缚有六个Ca2+,其中三个与连接点的亲合力较强,主要起稳定蛋白质结构的作用,另外三个的亲和力较弱,主要起调节催化功能。这六个Ca2+将阴离子占优势的一个凹陷处形成一个比较适宜的电解液微环境,以便束缚植酸。这种植酸酶蛋白质晶体结构模型是否是直接影响酶的热稳定性原因,还需要进一步的实验验证。213 液体植酸酶的热稳定性原酶液和加有10 mmolCaCl2溶液的酶液在不同温度(20-90e)下分别热处理10 min,取出后迅速冷却至常温,然后测定它们的相对酶活,结果如图3所示:t/e图3 处理温度对植酸酶稳定性的影响从图3可以看出,原酶液在70e时损失最大,当温度小于70e时相对酶活随温度的升高而下降,当温度大于70e时相对酶活随着温度的升高又稍有回升。对于植酸酶活性下降又微回升的现象,四川农业大学的陈惠9等人在研究黑曲霉9701植酸酶时发现在80e时酶活最低,而90e时,酶活又有#59#第1期段学辉等:甲醇酵母植酸酶的热稳定性回升。同样Markus Wyss10报道,烟曲霉植酸酶在50-70e发生热变性,而在90e时,活性又有所恢复。关于这种现象的理论解释,目前国内外还没有相关文献报道。当液体酶中加入10 mmolCaCl2后,其热稳定性明显提高,在70e时,酶活保持在87.3%,与原酶液相比,热稳定性提高了10多倍。随温度的升高酶活降低,但降低的幅度小于无Ca2+的原酶液,在90e下处理10 min,加有10 mmolCaCl2的酶液的相对酶活仍有70%。二者比较可清楚看出,Ca2+能够提高植酸酶对热变性的抵抗力,使其在一定的高温时间内保持较高的酶活力。214 颗粒化处理对植酸酶的热稳定性作用实验选择了三种不同颗粒化方法处理的植酸酶颗粒进行热稳定性对比研究,其处理方法如下:多羟基化合物颗粒化植酸酶:经浓缩和特殊处理的液体植酸酶与海藻酸钠、无机盐和多羟基化合物按比例在造粒机中充分混合,通过造粒机球形化和筛分制成细小的球形颗粒(0.5 mm),然后在40e热风烘干得到某一定单位的球形颗粒植酸酶制剂。无磷混合饲料吸附型植酸酶颗粒:将无磷混合饲料与浓缩处理的植酸酶溶液以一定比例均匀混合,然后在40e热风烘干,制成0.5 mm左右一定活性单位的无规则颗粒植酸酶制剂。球形(0.5 mm)嵌入式颗粒植酸酶制剂(国外N酶制剂公司购买)。三种不同的颗粒植酸酶制剂在95e条件下热处理,不同的时间取样冷却至常温,然后测定它们的残余酶活。结果如图4所示。t/min图4 高温热处理时间对颗粒植酸酶制剂的稳定性影响从上图中颗粒植酸酶在相同的高温下热处理不同的时间的残留活性比较结果,可以看出多羟基化合物颗粒化实验研制的植酸酶制剂的酶活下降比国外公司生产的嵌入式颗粒植酸酶制剂酶活下降速度慢,热稳定性好,在95e高温下热处理20 min内酶活基本能保持在80%以上,后者下降较快,高温热稳定性差。用普通吸附方法生产的颗粒植酸酶制剂,其高稳耐热性与前两种相比差距很大,当保温10 min时,其残余酶活已下降到6.2%,虽然随着保温时间的增加,其残余酶活没有继续下降,但作为饲料酶制剂,在饲料制粒温度下已没有实际意义。植酸酶作为一种具有催化活性的蛋白质,其催化功能的发挥需要高度有序的天然构象来保证。酶制剂发生热变性,其主要原因是由于在一定的温度下,酶蛋白失去了其原来所具有催化功能的构型,酶分子内基团间的相互作用在受热的情况下发生了变化,酶蛋白的二三级结构被破坏,原来的活性折叠结构打开,变成了松散的无序结构,最终导致了酶催化功能的丧失。而当植酸酶的基团与保护材料的热稳定剂分子结合后,能使酶的天然构象产生/刚性0结构,不易伸展打开,从而增强酶蛋白天然构象的抗压强度和高温稳定性12,所以多羟基化合物处理的颗粒植酸酶能够在高温条件下保持较高的活力。用吸附方法生产的植酸酶制剂耐热性较差,原因是由于酶吸附在麸皮等表面,仅仅是一种物理分子力作用,酶蛋白的各种次级键并没有和麸皮等化合物的基团发生结合,因而酶的构象没有得到强化,其次酶吸附在颗粒的表面,与包裹或嵌入式颗粒酶制剂相比,相同的质量其受热表面积较大,没有一个相对稳定的微环境,因而活性结构受热破坏极易,酶的热稳定性差。从以上结果对比中,可以看出应用多羟基化合物研制的颗粒植酸酶比国外进口的植酸酶制剂热稳定性更好,能够在饲料制粒温度下保持良好的活性。同时,多羟基化合物材料来源广泛,价格低廉,在制剂工艺和生产成本上,比进口的植酸酶制剂具有明显优势。3 结 论甲醇酵母发酵生产的液体植酸酶的热稳定性较差,在饲料制粒过程中容易失活,当在植酸酶液中添加一定浓度的Ca2+后,能够提高植酸酶的热稳定性,但液体难以在饲料中均匀分布和保存。颗粒酶制剂具有良好的流散性,颗粒化处理后,能够保护酶蛋白的构象稳定,提高植酸酶的热稳定性,适合饲料添加制粒应用。#60#南昌大学学报(理科版) 2003年参考文献:1 Michell D B,Vogel K.The Phytase Subfamily of Hist-idine Acid Phosphayase:Isolation of Genes For Two NovelPhytase From the Fungi Aspergillus Terreus and Myce-liophthora ThermophilaJ.Microbiology, 1997 (143):245-25212 于炎湖1植酸的抗营养作用及植酸酶在饲料中的应用(一)J1粮食与饲料工业,1999(2):25-2713 Dvorakova J.Phytase: Source,Preparation and Exploita-tionJ.Folia Microbiology 1998 (43): 323-33814 Reddy N R, Pierson M D. Phytase in Cereals andLegumesM.Boca Raton, F L,CRC Press,1989.5 Berridge M J.Inositol Trisphosphate and Calcium Signa-lingJ.Nature (London), 1993 (361): 315-32516 Craxton A,Caffrey J J.Molecular Cloning and Expressionof a Rat Hepatic Multiple Inositol Polyphosphate Phos-phataseJ.Biochem J,1997 (328): 75-8117 Van Der Heeft F C.Phytase Activity, Vanadate ManualMethod in Mineral Feed From BASF etcR.Gist-bro-cades Method Nr. 61696, 199618 Yang Mun Choi,Hyung Joo.Purification and Propertiesof Extracellular Phytase FromBacillusspJ.KHU-10Journal of Protein Chemistry,2001 20(4): 287-29219 Nam-Chul Ha, Byung-Chul Oh.Crystal Structures ofa Novel,Thermostable Phytase in Partially and Fully Ca-lcium-Loaded StatesJ.Nature Structural Biology,20007(2): 147-153110 陈 惠,王红宁1植酸酶产酶条件及热稳定性的研究J1四川农业大学学报,1999,17(3):291-294111 Markus Wyss.Comparison of the Thermostbility Proper-ties of Three acid Phosphatases From Mold.AspergillusFumigatus Phytase, A.Niger Phytase, and A.Niger pH2.5 Acid PhosphataseJ.Applied and Environment M-icrobiology 1998 (64): 4 446-4 451112 熊振平1酶工程J1北京:化学工业出版社,19891STUDY ON THE THERMAL STABILITY OFPHYTASE FROM METHANOL YEASTDUAN Xue-hui,SUN Jing-chao,ZENE Wen-bing(College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047,China)Abstr