双水相萃取技术资料整理.doc

双水相萃取技术Aqueous two phase extraction （ATPE） 化学系 应用化学 徐* 10101570*【摘要】介绍了双水体系的概念、双水相萃取的种类、原理，影响分配的因素。分析了双水相萃取的优势，双水相萃取的应用范围。列举了食品、化学、化工三个领域的应用实例。介绍了双水相技术与其他技术的结合。最后针对双水相萃取技术的特点及局限性对其应用前景进行了展望。1、基本概念1.1 双水体系双水体系指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间，在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶两项或者多项水相体系。成中大部分为水，可用于亲水性生物活性物质的萃取分离。1.2 双水相萃取的种类1.2.1双高聚物双水相体系两相都由溶解于水的高聚物组成，都具有高度的不互溶性，其成相机理是由于高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向。两相常常可能具有相近的密度，表面张力也较小，正因为如此，双水相体系分层比传统的溶剂萃取要困难，可通过离心分离等办法分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。可形成双水相体系的聚合物有很多，典型的聚合物双水相体系有：聚乙二醇（polyethylene glycol，略作PEG)/葡聚糖（dextran），聚丙二醇（polypropylene glycol)/聚乙二醇和甲基纤维素（methylcellulose)/葡聚糖等。1.2.2聚合物-盐双水相体系：双水相体系也可以由高浓度的盐溶液和高聚物溶液组成。其成相机理是盐析的结果，如PEG与碱性磷酸盐或硫酸盐形成的两相。一般，上相富含高聚物，下相富含无机盐。该双水相体系容易分离，且价格便宜。但是当盐浓度过高时，蛋白质会变性或从溶液中沉淀出来，所以此体系不太适用于蛋白质纯化。此类双水相体系一般采用聚乙二醇（PEG）作为其中一相成相物质，而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐。2、基本原理2.1 萃取原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等） 的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。2.2分配定律分配情况服从分配定律，即，“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。物质在双水相体系中的分配系数K等于两相中生物物质的浓度比，由于蛋白质的K值不相同（大致在1110之间），因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。分配系数K可用下式表示：K= C上/ C下 其中C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。2.3影响分配的主要参数影响分配的主要参数有聚合物的分子量和浓度、pH、盐的种类和浓度、温度等。适当选择各参数即在最适条件下，可达到较高的分配系数和选择性。 2.3.1成相聚合物的相对分子质量高聚物的相对分子质量对分配的影响符合下列一般原则:对于给定的相系统，如果一种高聚物被低相对分子质量的同种高聚物所代替，被萃取的大分子物质，如蛋白质、核酸、细胞粒子等，将有利于在低相对分子质量高聚物一侧分配。如PEG-Dextran系统中，PEG相对分子质量降低或Dextran相对分子质量增大，蛋白质分配系数将增大。相反，如果PEG相对分子质量增大或Dextran相对分子质量降低，蛋白质分配系数则减小。这一原则适用于不同类型的高聚物相系统，也适用于不同类型的被萃取物质。 2.3.2成相系统的总浓度当接近临界点时，生物大分子均匀地分配于两相，分配系数接近于1。如成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过1,或减小低于1。增大时,系统远离临界点,系线长度增加,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相。 2.3.3盐类的影响由于各相应保持电中性，因而在两相间形成电位差，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产生很大影响。加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。当盐类浓度很大时(1-5 mol/L NaCl)，则由于盐析作用，蛋白质易分配于上相。由于HPO42-离子在PEG-葡聚糖系统中的分配系数很小，因而加入pH大于7的磷酸盐缓冲液能很方便地改变相间电位差，而使带负电荷的蛋白质移向富聚乙二醇的相。 2.3.4 pH值pH会影响蛋白质中可以解离基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。pH也影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4-和HPO42-之间的比例，也会使相间电位发生变化，而影响分配系数。2.3.5 温度温度的影响是间接的。大规模双水相萃取一般在室温下进行，不需冷却，因为（1） 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质一般不会发生失活或变性； （2） 常温下溶液粘度较低，容易相分离；（3） 常温操作节省冷却费用。 2.3.6荷电PEG作为成相聚合物在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差 相间电位差与电荷数成反比，利用带电PEG能产生较大的相间电位，故能使分配系数增加。 3、双水相萃取的优势ATPE作为一种新型的分离技术，对生物物质（蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等）、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势：（1）含水量高（70%-90%），在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用。（2）可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；（3）分相时间短，自然分相时间一般为5min15 min；（4）界面张力小（10-7 10-4mN/m），有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角几乎是直角；（5）不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；（6）大量杂质可与固体物质一同除去；（7）易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；（8）操作条件温和，生物相容性高。整个操作过程在常温常压下进行；（9）亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。虽然该技术在应用方面已经取得了很大的进展，但几乎都是建立在实验的基础上，到目前为止还没能完全清楚地从理论上解释双水相系统的形成机理以及生物分子在系统中的分配机理。4、应用范围4.1酶的提取与纯化双水相的应用始于酶的提取，但由于PEG/精葡聚糖体系太贵，而粗葡聚糖粘度太大。目前研究和应用最多的是PEG/盐体系。在这体系中酶在上相上，菌体分配在下相或界面上。如果有合适的条件，不仅可以从发酵液中提取酶，实现与菌体的分离，而且还可以将各种酶彼此分离。4.2生物活性物质的分析检测生物分子，常需要另一种与其定量复合的分子，只要复合物和反应物之一在双水相中具有不同的分配系数，并最好能分配在不同的相中，就能更好的进行分析。双水相萃取技术已成功的应用于免疫分析，生物分子相互作用测定细胞数的测定。4.3 DNA纯化从样品中提取DNA的技术对于现代生物技术尤为重要，但是样品中常常含有核酸酶，它会将目标DNA在被提取之前便分解。实验表明，在聚合物-盐双水相体系中，DNA片段会分离在体系上层，通过某种配体，核酸酶会被分离到体系下层并失去活性。因此聚合物-盐双水相体系在纯化DNA同时保护DNA不被核酸酶分解这一方面应用广泛。4.4食品工业PEG/氯化钠体系在分离小分子（如多肽、核酸）方面十分有效。这些化合物经常出现在食品添加剂中，所以该体系可以被食品工业应用，分离或者去除特定的香味、甜味等等5、应用实例5.1应用双水相萃取技术提取双孢蘑菇多糖利用PEG/ （NH4） 2SO4双水相体系萃取双孢菇多糖称取一定量的PEG溶于10 mL双孢菇多糖提取液中，再称取一定量的（NH2） 2SO4溶于10 mL提取液中。搅使其溶解，并将二者倒进同一个50 mL离心管中。充分摇匀，静置待其分相完全，离心5 min，溶液形成两相，记下上下相的体积，再用移液管将两相分离。两相各取1 mL到试管中，加水稀释。再从稀释液中取1 mL加0.5 mL 6 %苯酚和2.5 mL浓硫酸，充分摇匀，静置30min后用可见分光光度计在490 nm下侧吸光度值。对照组是用蒸馏水代替双孢菇提取液。5.2 双水相萃取法分离铍()、铁()与铁()、铬()、锰()、铝()铍()在pH 357o及铁(1I)在pH 4o70范围内可以被PEG相几乎完全萃取，而铝()、铬()在pH 1O70、锰(1I)在pH 1o45、铁()在pH 1o45则不被萃取。从而实现了将铍()(pH 35)、铁()(pH 50)与铝()、铬()、锰()、铁()混合离子的定量分离。5.3 利用双水相乙醇-磷酸氢二钾体系萃取甘草有效成分基于与水互溶的普通有机溶剂的双水相萃取体系，根据分相后有机溶剂相的体积变化，选择乙醇(Et0H)一磷酸氢二钾(K2HPO4)体系萃取甘草有效成分。确定萃取的最佳条件是：当双水相体系的总量为lOmL，y(EtOH)：r(H2O)=3：2，磷酸盐的质量为1.5 g，在上述条件下，EtOHK2HPO4体系的两相分配完全，分配系数(K)最大为1280，收率(r)高达983。6、双水相技术与其他技术的结合双水相萃取是基于液-液萃取技术同时考虑保持生物活性所开发的一种新型生物分离技术。该技术具有分离时间短、易于连续操作、保持生物活性等优点。为了提高该技术的专一性，加快萃取速率，解决易乳化的问题，双水相萃取技术与其他几种生物分离技术（亲和色谱、膜分离、吸附剂微粒吸附、电泳）的结合解决了以上问题，从而促进了双水相萃取技术的进一步发展。6.1 双水相萃取技术与亲和色谱技术的结合亲和色谱是利用偶联亲和基团的色谱吸附介质为固定相，亲和吸附目标分子，使目标分子得到分离纯化的色谱方法。亲和色谱具有分离过程简单、纯化倍数高、选择性强，在蛋白质的分离纯化领域占据重要地位。为了提高双水相萃取的专一性，正是借鉴亲和色谱的以上优点，发展了一种亲和双水相分配技术。该技术对成相聚合物进行修饰，即将亲和配基通过（如离子交换基团、疏水基团、染料配基、金属螯合物配基以及生物亲和配基等）通过化学交联或分配的方法结合到成相聚合物上，有选择的将某种蛋白萃入该相中，而杂蛋白仍旧留在另一相中。亲和分配具有以下优点：直接处理发酵液及细胞破碎液；传质阻力小，传质速率快；处理量大，也易于放大。目前，利用该技术已成功地实现了-干扰素、甲酸脱氢酶和乳酸脱氢酶等多种生物制品的大规模提取。6.2 双水相萃取技术与膜分离技术的结合 由于双水相体系两界面张力极低从而易产生乳化现象。用膜将双水相体系隔开后可以增大体系两界面的张力从而避免了乳化作用以及生物大分子在两界面的吸附。利用中空纤维膜传质面积大的特点，将膜分离与双水相萃取相结合，还可以大大加快萃取传质的速率。6.3 双水相萃取与吸附微粒的结合利用带配基的吸附剂微粒吸附目标产物后，因该微粒与杂蛋白的分配系数不同从而使得吸附微粒与杂蛋白分别存在于不同的相中以达到分离的目的。这种分离技术适合分离一些难以分离的生物大分子。其优点是微粒可以偶联多个配基，微粒的分离与再生以及聚合物的回收比较容易。例如：用偶联了蓝色染料配基的琼脂糖凝胶微粒吸附经破碎处理后的粗提纯，然后将该微粒加到PEG/DEX体系中，吸附了目标产物的微粒分配于上相（富含PEG），而细胞碎片和杂蛋白则留在下相（DEG）,从而达到分离的目的。36.4双水相萃取与电泳技术的相结合电泳是指带电荷的胶体离子在直流电场中移动的现象。电泳是一种新型的分离技术即在电场的作用下，分离和鉴定混合物中的带电粒子（离子、胶体粒子、高分子多电解质等）的技术。双水相电泳是双水相萃取技术与电泳的结合，是一种新型的分离技术。由于双水相具有生物相溶性，所以双水相电泳技术为生物分子的成功分离提供了很好的方法。Kocherginsky利用葡萄糖/聚乙烯与乙二醇/水系统分离氨基酸，在间歇设备中对影响分离的因素，热分离时间、电场强度、两相接触面积、初始溶解浓度和相间作用力等进行了研究。实验结果表明：时间延长，电场强度增大以及增大两相接触面积可使界面上的传质速率显著增加；适当地调节两相间的体积比以及其他影响因素，就可以达到氨基酸的完全分离。并且改变电场方向可以使氨基酸进入到指定的相中。可见，在氨基酸的分离中双水相电泳是一种高效的分离技术。7、 结论液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一，在生物化工中也有广泛的应用。然而，大部分生物物质是有生物活性的，需要在低温或者是问天剑下进行分离纯化，而采取传统萃取技术无法完成。双水相萃取就是考虑到这一现状，基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。但双水相萃取技术体系并不完善，有很多需要解决的问题，其中很主要的一个是萃取剂的回收，还有其原料