乳酸菌和酵母菌混合培养条件优化研究.doc

乳酸菌和酵母菌混合培养条件优化研究摘 要:对乳酸链球菌和酿酒酵母菌进行混合培养发酵，通过讨论溶氧、温度、pH值、接种量、接种比例和培养基对其发酵结束时活菌数的影响，确定两种菌在前期28摇床150r/min 培养24h，后期37静置24 h，初始pH为7.5，接种量为0.5%，接种比例乳酸菌 酵母菌为1% 0.5%，培养基为YEPD时，两者的活菌数水平达到最高值，乳酸菌达50108CFU/mL，酵母菌达10108CFU/mL。关键词:混合培养; 酵母菌; 乳酸菌Study on Optimization of Mixed Culture Conditions for Lactic Acid Bacteria and YeastAbstract: Lactococcus lactis and Saccharomyces cerevisiae were cultivated and fermented together，and the impacts of dissolvedoxygen，temperature，pH value，inoculum size，inoculation proportion，and culture medium on the number of viable count at theend of their fermentation were investigated The optimized mixed culture conditions for these two bacteria were obtained as follows:culture for 24 hours in shaker at 150 r / min at 28 in earlier period，stewing for 24 hours at 37 in later period，the initial pHvalue was 7 5，the inoculum size was 0 5% ，the inoculation ratio of lactic acid bacteria to yeast was 1% 0 5% ，and the culturemedium was YEPD Under these conditions，the number of viable count of lactic acid bacteria and yeast reached the highest value，being 5 0 108and 1 0 108CFU / mL respectivelyKey words: Mixed culture; Yeast; Lactic acid bacteria乳酸菌和酵母菌对人类来说，是非常有益的微生物菌种，人类在很早的时候就从大自然的变化中学到了利用酵母菌进行酿酒、发面、制曲等工艺，利用乳酸菌制作风味乳制品等。在现代化工艺生产中，越来越多的用到了两种菌进行发酵，例如发酵豆粕、微生态制剂等。但是对于两者混合培养发酵的报道还不是很多，两者之间如果能够混合培养而且活菌数水平并不下降的情况下，可以大大节约发酵能源消耗。本文通过对 2 种菌混合培养条件的讨论，旨在为大规模生产乳酸菌和酵母菌提供理论基础。1 材料与方法1 1 材料1 1 1 菌种 乳酸链球菌( Streptococcus lactis) 、酿酒酵母菌( Saccharomyces cerevisiae) 均为河南微生物饲料研究中心保藏。1 1 2 培养基 MS 液体培养基: 胰蛋白胨 1% 、酵母浸粉 05%、葡萄糖 2%、牛肉蛋白胨 1%、吐温 801% 、K2HPO40 2% 、结晶乙酸钠 0 5% 、柠檬酸三铵0 2% 、MgSO47H2O 0 02% 、MnSO44H2O 0 005% ，pH 值 6 8，用于制备乳酸菌种子液; YEPD 培养基: 胰蛋白胨 2%、酵母浸粉 1%、葡萄糖 2%，用于制备酵母菌种子液; 乳酸优化培养基: 酵母浸粉 1%、葡萄糖0 5% 、结晶乙酸钠 0 5% 、柠檬酸三铵 0 2% 、吐温 801% 、K2HPO40 2% ，用于混合培养时降低培养基成本;酵母优化培养基: 豆粕粉 3%、玉米粉 2%、麸皮 1%、葡萄糖 3%，用于混合培养时降低培养基成本。以上培养基均在 121 下灭菌 20 min。1 1 3 主要仪器设备 立式高压灭菌锅、电子天平、显微镜、超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、pH 计、1吨立式发酵罐。1 2 方法1 2 1 溶氧对混合菌体生长的影响 在 MS 液体培养基中按乳酸菌 酵母菌为11的比例接种，前期150 r/min 震荡培养，后期静置培养，培养温度为 30 ，总培养时间为 48 h，震荡时间设 8、16、24、32 h 4 个处理，培养完后分别检测乳酸菌和酵母菌的数量。1 2 2 温度对混合菌体生长的影响 在 MS 液体培养基中按乳酸菌 酵母菌为11的比例接种，前期150 r/min 震荡培 24 h，后期静置培养 24 h，培养温度设置为28 恒温 48 h、28 恒温 24 h，37 恒温 24 h、37 恒温 48 h 3 个温度梯度。培养完后分别检测乳酸菌和酵母菌的数量。1 2 3 pH 对混合菌体生长的影响 采用 pH 计测定pH 值。在 MS 液体培养基中设起始 pH 值为 4 5、5 5、6 5、7 5 4 个处理，按乳酸菌: 酵母菌为 1 1的比例接种，前期 28 、150 r/min 震荡培 24 h，后期 37 静置培养 24 h、培养完后分别检测乳酸菌和酵母菌的数量。1 2 4 接种比例对混合菌体生长的影响 在 MS 液体培养基中进行试验，按乳酸菌( 5 0 108CFU / mL)与酵母菌( 10 108CFU / mL) 为 1% 0 5% 、1% 1% 、1% 1 5% 、1% 2% 接种量进行接种，前期 28 、150r / min 震荡培 24 h，后期 37 静置培养 24 h。培养完后分别检测乳酸菌和酵母菌的数量。1 2 5 接种量对混合菌体生长的影响 在 MS 液体培养基中进行试验，按乳酸菌( 5 0 108CFU / mL) 与酵母菌( 10 108CFU / mL) 为 1% 0 5% 接种量进行混合，制得 2 种菌的混合种子，将混合种子按 0 1%、0 5% 、1% 进行接种，前期 28 、150 r / min 震荡培 24h，后期 37 静置培养 24 h。培养完后分别检测乳酸菌和酵母菌的数量。1 2 6 培养基对混合菌体生长的影响 在 YEPD、乳酸优化培养基、酵母优化培养基这 3 种培养基上进行试验，按乳酸菌( 5 0 108CFU / mL) 与酵母菌( 1 0 108CFU / mL) 为 1% 0 5% 接种量进行混合，制得 2 种菌的混合种子，将混合种子按 0 5% 进行接种，前期 28 、150 r / min 震荡培 24 h，后期 37 静置培养 24 h。培养完后分别检测乳酸菌和酵母菌的数量。2 结果与分析2 1 震荡时间对混合菌体生长的影响 由表 1 可知，随着震荡时间的延长，培养物中的酵母菌总数增多，到震荡 24 h 时达到最高值，震荡到 32 h 后反而开始下降，说明震荡时间过长，酵母菌随着震荡反而会有所死亡; 乳酸菌也随着震荡时间的延长而活菌数增加，到震荡 24 h 时达到最高值，震荡到 32 h 后也开始下降，说明静止培养时间过短，也不利于乳酸菌的生长繁殖。从两种菌的培养结果来看，在处理 3 中活菌数为最高，其中乳酸菌处理 3 显著( P 0 05) 高于处理 1 和处理4; 酵母菌处理 3 显著高于处理 1; 故选择处理 3 的方式即前期 150 r/min 震荡培养24 h，后期静置培养24 h 为混合培养的最佳溶氧条件。表 1 震荡时间对混合菌体生长的影响处理 震荡时间/h 酵母菌数/( 108CFU / mL) 酵母菌数 0 05 水平 乳酸菌数 / ( 108CFU / mL) 乳酸菌数 0 05 水平1 8 0 01 5 99 0 13 b 2 3 8 36 0 07 c2 16 0 60 7 78 0 03 a 4 9 8 69 0 06 ab3 24 0 83 7 89 0 20 a 5 5 8 74 0 03 a4 32 0 64 7 80 0 13 a 4 0 8 59 0 11 b注: 同列字母不同表示在 0 05 水平上差异显著。下同。2 2 温度对混合菌体生长的影响 由表 2 可知，乳酸菌活菌数在 3 个处理中表现无差异( P 0 05) ，处理 3中乳酸菌活菌数为最高，达到 2 7 108CFU / mL; 酵母菌处理 1 和 2 显著高于处理 3( P 0 05) ，其中处理 2酵母菌活菌数为最高，达到051 108CFU / mL; 从两种菌的活菌数和生产能耗来看，两者混合培养的最佳温度以前期28 培养24 h，后期37 培养24 h 较合适。表 2 温度对混合菌体生长的影响处理 温度 酵母菌数/( 108CFU / mL) 酵母菌数 0 05 水平 乳酸菌数 / ( 108CFU / mL) 乳酸菌数 0 05 水平1 28 0 470 7 66 0 12 a 2 0 8 25 0 27 a2 先 28 ，再 37 0 510 7 70 0 11 a 1 8 8 26 0 10 a3 37 0 057 6 75 0 06 b 2 7 8 43 0 03 a2 3 初始 pH 值对混合菌体生长的影响 由表 3 可知，乳酸菌活菌数在 4 个处理中表现差异显著( P 005) ，处理 4 中乳酸菌活菌数显著高于前 3 个处理; 酵母菌处理 2 显著高于处理 4 和处理 1( P 0 05) ，但处理 3 个处理 4 差异不显著( P 005) ，这说明对于乳酸菌来说，由于发酵过程产酸会抑制其生长繁殖，所以初始 pH 在 75 时乳酸活菌数水平最高，但是对于酵母菌来说，比较适合生长的 pH 值范围偏酸性，即初始 pH在 55 时酵母菌活菌数水平为最高。从两种菌的总活菌数来看，两者混合培养时初始 pH 为 7 5 时最高，如果实际生产中初始 pH 为 6 5 7 5 之间，也可不调整初始 pH 值。2 4 接种比例对混合菌体生长的影响 由表 4 可知，从乳酸菌差异性分析结果来看，4 个处理之间差异不显著( P 005) ，从活菌数平均值来看，处理 1 的乳酸菌活菌数为最高，但还是没达到乳酸的以往最高值，主要原因是乳酸接种量的减少( 从 0 5 mL 减至 0 1 mL) ;从酵母菌差异性分析来看，处理 1 显著高于( P 005)处理 2、3、4 组，所以可以选择处理 1 的接种比例为最佳接种比例。1 22江 西 农 业 学 报 25 卷表 3 初始 pH 对混合菌体生长的影响处理 初始 pH 酵母菌数/( 108CFU / mL) 酵母菌数 0 05 水平 乳酸菌数 / ( 108CFU / mL) 乳酸菌数 0 05 水平1 4 5 0 28 7 43 0 10 c 0 09 6 96 0 13 d2 5 5 0 68 7 83 0 03 a 1 10 8 03 0 02 c3 6 5 0 62 7 79 0 07 ab 3 10 8 51 0 09 b4 7 5 0 45 7 65 0 09 b 4 70 8 67 0 02 a表 4 接种比例对混合菌体生长的影响处理接种比例( 乳酸菌 酵母菌)酵母菌数/( 108CFU / mL)酵母菌数 0 05 水平乳酸菌数/( 108CFU / mL)乳酸菌数 005 水平1 1% 0 5% 0 77 7 89 0 04 a 2 2 8 28 0 30 a2 1% 1% 0 48 7 67 0 08 b 1 1 8 05 0 02 a3 1% 1 5% 0 45 7 65 0 04 b 1 8 8 24 0 18 a4 1% 2% 0 49 7 69 0 05 b 1 7 8 21 0 12 a2 5 接种量对混合菌体生长的影响 由表 5 可知，从乳酸菌活菌数 005 水平来看，各处理之间无差异( P 0 05) ; 从酵母菌活菌数 0 05 水平来看，处理 2 与处理1 差异显著( P 0 05) ，处理 3 和处理 1、2 均无差异( P 0 05) ; 综合两种菌的活菌数，可在实际生产中按处理 2 即各 05%的比例来接种。表 5 接种量对混合菌体生长的影响处理接种量( 乳酸菌 酵母菌)酵母菌数/( 108CFU / mL)酵母菌数 0 05 水平乳酸菌数/( 108CFU / mL)乳酸菌数 005 水平1 0 1% 0 47 7 66 0 10 b 2 5 8 39 0 09 a2 0 5% 0 65 7 81 0 02 a 3 3 8 52 0 09 a3 1 0% 0 51 7 70 0 04 ba 2 4 8 37 0 02 a2 6 培养基对混合菌体生长的影响 由表 6 可知，从乳酸菌活菌数 005 水平来看，各处理之间无差异( P 0 05) ; 从酵母菌活菌数 0 05 水平来看，处理 1 与处理2 和 3 差异显著( P 0 05) ; 综合两种活菌数，可在实际生产中按处理 2 即 YEPD 的培养基来进行混合培养。如果考虑经济成本，也可以按照处理 3 即酵母优化培养基进行混合培养。表 6 培养基对混合菌体生长的影响处理 培养基 酵母菌数/( 108CFU / mL) 酵母菌数 0 05 水平 乳酸菌数 / ( 108CFU / mL) 乳酸菌数 0 05 水平1 乳酸优化培养基 0 66 7 82 0 09 b 3 2 8 49 0 09 a2 YEPD 1 00 8 01