第4章细菌的生化试验.doc

第四章 细菌的生化试验微生物生化反应：指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。微生物检验中常用的生化反应有： 糖或醇类发酵试验 淀粉水解试验 V-P试验甲基红（MR）试验 靛基质（Indole）试验 过氧化氢酶试验硝酸盐还原试验 明胶液化试验 尿素酶（Urease）试验 氧化酶试验 硫化氢（H2S）试验 三糖铁（TSI）琼脂试验氨基酸脱羧酶的测定 耐盐性试验 卵磷脂酶的测定石蕊牛奶反应 酪蛋白水解 苯丙氨酸脱氨试验氰化钾试验 对叠氮化钠的抗性 硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验含碳化合物的利用（柠檬酸盐或丙酸盐利用）第一节 细菌的生化试验一、概述（一）、什么是生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。（二） 检验细菌的生化试验范围1、糖（醇）类代谢试验2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验4、呼吸酶类试验5、毒性酶类试验（三）生化试验的方法在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。（四）生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。培养1824h。2、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑似菌落分别进行试验。二、糖醇类代谢试验（一） 糖醇类发酵试验1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇），有的只能分解12种糖醇 ，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇2、试验方法： 用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置361.0 培养13天，每天观察结果。3、结果观察和记录记录：产酸不产气，阳性，以“+”表示产酸产气，阳性，以“”表示不产酸产气，阴性，以“-”表示（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验1、原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。2、方法取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37培养24h天，每天观察结果。3、结果观察与记录（三） V-P试验1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。2、试验方法（）奥梅拉法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 培养48h， 每1ml培养液加奥梅拉OMeara试剂0.1ml，摇动试管12min，静置于37恒温箱4h ，或在4850 水浴放置2h后判定结果。（2）贝立脱法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361培养2天，每2ml培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1ml，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动25min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361 培养 4h ，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。（3）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。3、结果观察与记录（1）发酵管出现红色者，为阳性， 记V-P +（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P -（四）甲基红试验（MR）1、原理细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。2、试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 或30 （以30 较好）培养35天，从第48h起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂12滴，立即观察结果。MR-VP试验原理及照片3、结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +；（2）呈橘黄色或黄色为阴性， 记MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。（五） 七叶苷水解试验、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。2、试验方法：将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于361 培养24h,观察结果。3、结果观察与记录（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为 +（2）培养基不变色者，为阴性，记录为 -（六） 甘油品红试验1、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。2、试验方法：取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于361 培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。3、结果观察与记录（1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+；（2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-复习题1、什么是生化试验?2、做生化试验要注意哪些事项？3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法和结果的记录5、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录（一）靛基质（吲哚）试验（二）H2S试验（三）尿素酶试验（四）氨基酸脱羧酶试验（五）苯丙氨酸脱氨酶试验 (六) 明胶（Gelatin）液化试验（一） 靛基质试验1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。2、试验方法：所用试剂:（1）柯凡克(Kovacs)试剂;（2）欧波试剂将待检菌小量接种于培养基中，于361 培养2448h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。靛基质试验原理及照片 3、结果观察与记录呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+无红色者，为阴性反应，记-（二） 硫化氢（H2S）试验1、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。2、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于361培养2448h，观察结果。3、结果观察与记录培养基底部呈黑色，为阳性，记+培养基底部无黑色，为阴性，记-（三） 尿素酶试验1、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。2、试验方法：挑取大量培养1824h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。尿素酶试验图 3、结果观察与记录培养基变呈粉红色，为阳性，记 +培养基颜色不变，为阴性，记 -（四） 氨基酸脱羧酶试验1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。2、试验方法取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在361 培养14天，每天观察结果。3、结果观察与记录试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记 +试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记 -。阳性反应试验管颜色变化过程紫色黄色紫色原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（1012h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，PH又回升至碱性，指示剂显紫色。（五） 苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。2、试验方法从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在361 培养1824h后，加入氯化铁溶液45滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。3、结果观察与记录试验管立即出现绿色，为阳性，记 +无色为阴性，记 -。（六） 明胶液化试验1、原理有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。2、试验方法挑取培养1824h的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于361。另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置2030min后，再观察结果。3、结果观察与记录明胶液化，为阳性，+。明胶凝固，为阴性，-。复习题1、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项2、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项3、简述尿素酶试验的原理，写出其试验方法、结果的记录4、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理四、 有机酸盐和铵盐的利用试验枸橼酸盐利用试验丙二酸盐利用试验（一） 枸橼酸盐利用试验1、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。2、试验方法挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在361 培养14天，每天观察结果。3、结果观察与记录斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-枸椽酸盐试验原理及斜面照片 （二） 丙二酸盐利用试验1.原理:某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。2、试验方法取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于361 培养48h，观察结果。3、结果观察与记录培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+;培养基无颜色变化,为阴性,记-五、 呼吸酶类试验氧化酶试验过氧化氢酶试验硝酸盐还原试验氰化钾试验（一） 氧化酶试验1.原理:氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。试剂1% -萘酚-乙醇液1%盐酸二甲基对苯二胺2、试验方法用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂12滴在培养物上,再加入1% -萘酚-乙醇液12滴, 在30秒内判定试验结果。3、结果观察与记录在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记 +不变色或为红色者,为阴性,记 -（二） 过氧化氢酶试验1.原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。2、试验方法挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。3、结果观察与记录产生气泡者，为阳性，记+不产生气泡者，为阴性，记-（三）硝酸盐还原试验1、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应。试剂A、对氨基苯磺酸试剂B、-萘胺试剂2、试验方法取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在361 培养14天，每天取2mL培养液,加入A、B试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。3、结果观察与记录呈现红色，为阳性，记+若无红色出现，为阴性，记-（四） 氰化钾试验1.原理：氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.2、试验方法取培养2024h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，361 培养24 48h，观察结果。3、结果观察与记录对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记-。 六、毒性酶类试验（一） 溶血试验1、原理： 某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。2、试验方法有二种：平板法将培养物接种于血平板培养基上，361 培养24 48h，观察结果。溶血试验的溶血类型及现象（1） （甲型）溶血: 菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。（2） （乙型）溶血: 菌落周围出现较宽的透明溶血环。（3）（-丙型）溶血: 菌落周围无溶血环。试管法将待检菌培养液与等量的2%羊血球混合，在361 培养16 18h，观察结果。如溶血，培养液可出现透明状。3、结果观察与记录有溶血现象，为阳性，记+；无溶血现象，为阴性，记 -（二） 链激酶试验1、原理： A群链球菌群能产生链激酶，该酶能使血液中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，而后溶解纤维蛋白，使血凝块溶解 ,为阳性反应。此试验用于测定链球菌的致病性。阳性反应具有致病性。2、试验方法吸取草酸钾血浆0.2 mL(0.01 g草酸钾加5 mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液)，加入0.8 mL生理盐水，混匀后，再加入待检菌36下培养18-24h肉汤培养物0.5 mL和0.25氯化钙0.25 mL，混匀，放37水浴中，2 min观察一次。3、结果观察与记录如凝块全部溶化,为阳性+，凝块24 h仍不溶化,为阴性-（三）卵磷脂酶试验1、原理：某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环，或使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。2、试验方法（1）卵黄平板法：A法：将待检菌培养物划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，361 培养3 6h，观察结果。B 法：先用卵黄磷脂酶抗血清将平板涂一半，置于36 待干后，将待检菌接种于未涂抗血清的一半卵黄琼脂平板上，再转划已涂过抗血清的一半，361 厌氧培养24 48h，观察结果。在未涂抗血清的一半平板上，菌落周围形成较大的不透明乳白色混浊区，在涂抗血清的一半平板上，菌落周围无不透明混浊区，为阳性。两边均无不透明区，为阴性。（2）卵黄盐水法将庖肉培养基培养物经除菌过滤，收集滤液。在两支灭菌试管内，每管加入1%卵黄盐水0.4mL,在一管中加入滤液0.2mL，另一管加入生理盐水0.2mL作对照。在36 水浴中，经2h、 4h、 8h、 24h观察结果。管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。3、结果观察与记录菌落周围形成较大的不透明区，为阳性。两边均无不透明区，为阴性。管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。两管无沉淀者，为阴性。（四） 血浆凝固酶试验1、原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。2、试验方法（1）玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5 min内,如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为阳性;如两者呈均匀混浊，无凝固则为阴性。（2）试管法 取灭菌小试管3支，各加入血浆无菌水(1:1)0.5ml，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml；其余2支作对照管，1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9氯化钠溶0.5ml作空白对照。将3管同时放37温箱或水浴中培养，每0.5 h观察一次， 4 h 内无凝固现象者，观察直至24小时。3、试管法的结果观察与记录空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；均无凝固则为阴性。七、 三糖铁（TSI）试验1、三糖铁试验的原理如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。 2、试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置361培养1824h，观察结果。思考题提问：志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。在培养基上应该产生什么现象？大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。在培养基上应该是什么现象？沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气，在培养基上应该是什么现象？下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？ 复习题1、什么是生化试验?2、做生化试验要注意哪些事项？3、简述糖酵解试验的原理，写出其试验方法和结果的记录4、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录5、简述靛基质（Imdole） (吲哚)试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项6、简述硫化氢（H2S）试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项7、简述尿素酶（Urease）试验的原理，写出其试验方法、结果的记录8、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理9、简述氰化钾试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项10、写出溶血试验的溶血类型及现象11、简述链激酶试验的原理，12、简述血浆凝固酶试验的原理，并写出玻片法的试验方法13、简述三糖铁（TSI）试验的试验的原理第二节 血清学试验血清学反应：指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，所出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。一、抗原与抗体（一）抗原1、抗原的概念抗原(Ag)：是指凡能刺激机体免疫系统诱导免疫应答，并能与应答产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。2、抗原的特性免疫原性免疫反应性（二）抗体1、抗体是指机体内的淋巴系统细胞在抗原物质的激发下，所合成的一种具有特异性免疫功能的球蛋白(免疫球蛋白)。2、抗体的理化性质（1）抗体是球蛋白 （2）免疫球蛋白（三）抗原抗体反应 抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应1、抗原抗体反应的化学本质（1）结构基础（2）、化学变化： 四种分子间作用力参与并促进Ag-Ab的反应电荷引力、范登华引力、氢键结合力、疏水作用抗原抗体反应的胶体状态的变化过程总结如下。 2、反应过程：不可见阶段可见阶段二、血清学反应的特点：1、具有特异性与交叉性2、具有敏感性3、具有定理特性。4、反应的两个阶段性5、反应的稳定性与可逆性的。三、影响血清学试验的的因素1.抗体2.抗原3. 电解质:常用:0.85氯化钠或各种缓冲液作用:中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降，促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。4. 酸碱度: pH为68进行5. 温度:一般以1540为宜，最适为37，四、 血清学反应的种类1、凝集反应2、沉淀反应 3、中和反应4、标志抗体技术（一）凝集试验颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（二）凝集试验的方法1直接凝集法 2间接凝集法 3抗球蛋白试验（三）直接凝集试验1、玻片凝集法（1）原理:用已知抗体作为诊断血清，来检测未知抗原,以鉴定相应的抗原。（2）方法步骤:、于洁净玻片的一端加诊断血清1滴，另一端加生理盐水1滴作为阴性对照。、用接种环取