第七章 线粒体与过氧化物酶体.doc

第七章 线粒体与过氧化物酶体1. 从线粒体的发现和功能鉴定的简史中，你有何体会?答: 1850年，德国生物学家Rudolph K?lliker第一个发现在肌细胞的细胞质中存在着一种规则排列的颗粒，并且从肌细胞中分离到这些颗粒。发现将分离的颗粒放置在水中能够膨胀，为此推测这种颗粒是由半透性的膜包被的。1898年，有人首次将这种颗粒命名为线粒体，意思是“类似线状的颗粒”(thread-like granule)，并很快被大家所接受。1900年，Leonor Michaelis在线粒体的功能研究方面取得了突破性的进展。他用染料Janus green对肝细胞进行染色，这种染料将线粒体染成绿色。当细胞消耗氧之后，线粒体的颜色逐渐消失了，当时已经了解这种颜色的变化是颜料的氧化还原状态改变的结果，从而提示线粒体具有氧化还原反应的功能。1913年，Otto Warburg从细胞匀浆质中分离了线粒体，并发现它能够消耗氧。但是，这些发现当时并没有引起生物学家足够的重视，因为人们普遍认为线粒体的作用主要是参与分化细胞遗传特性的转变。人们真正注意线粒体在能量代谢中的作用是分离纯化方法的发展和线粒体独立功能的研究。在20世纪40年代早期，Arbert Claude开创了细胞组分分离技术，能够将线粒体与其他细胞组分分开。但他所用是盐法，而盐会破坏线粒体的作用，所以用这种方法分离的线粒体看不到有关Krebs循环以及呼吸链的成份。1948年，George Hogeboom、Walter Schneider 和 George Palade等终于分离到具有生物活性的线粒体，他们采用的分离介质是蔗糖而不是盐，因此不会破坏线粒体。分离方法上的突破，使得Eugene Kenedy和Albert Lehninger 证明了线粒体具有Krebs循环、电子传递、氧化磷酸化的作用，从而证明了线粒体是真核生物进行能量转换的细胞器。体会是四点:关于膜结构的推测; 功能的推测;方法的发展; 方法的革新。2. 线粒体外膜的通透性差,又没有电子传递装置, 所以没有什么作用, 此说正确吗? 答: 不正确。虽然外膜中外膜含有孔蛋白, 最大可允许5,000道尔顿的分子通过,由于ATP、NAD、辅酶A等的相对分子质量都小于1,000道尔顿,因此这些分子都能自由通过外膜。所以外膜的通透性非常高,使得膜间隙中的环境几乎与胞质溶胶相似。但是它有两个重要的作用: 一是建立了膜间隙,有利于建立电化学梯度；第二是外膜含有一些特殊的酶类，如参与色氨酸降解、脂肪酸链延伸的酶,表明外膜不仅参与膜磷脂的合成，同时对那些将在线粒体基质中进行彻底氧化的物质先行初步分解。外膜上含有单胺氧化酶(monoamine oxidase),该酶是外膜的标志酶,这种酶能够终止胺神经递质,如降肾上腺素和多巴胺的作用。3. 比较线粒体外膜、内膜、膜间隙和基质的化学特性和功能的主要差别。 答: 外膜是线粒体最外的一层全封闭的单位膜结构，是线粒体的界膜，厚67nm, 平整光滑。外膜含有孔蛋白, 所以外膜的通透性非常高,使得膜间隙中的环境几乎与胞质溶胶相似。外膜含有一些特殊的酶类，外膜上含有单胺氧化酶(monoamine oxidase),该酶是外膜的标志酶,这种酶能够终止胺神经递质,如降肾上腺素和多巴胺的作用。外膜的主要作用是形成膜间隙， 帮助建立电化学梯度， 同时能进行一些生化反应，协助线粒体内膜和基质完成能量转换功能。内膜是位于外膜的内侧包裹线粒体基质的一层单位膜结构， 厚56nm。内膜的通透性较低，一般不允许离子和大多数带电的小分子通过。内膜的蛋白与脂的比例相当高，并且含有大量的心磷脂(cardiolipin)，约占磷脂含量的20%，心磷脂与离子的不可渗透性有关。线粒体内膜通常要向基质折褶形成嵴(cristae)， 嵴的形成使内膜的表面积大大增加。线粒体内膜的嵴上有许多排列规则的颗粒称为线粒体基粒(elementary particle)，即ATP合酶(ATP synthase)，又叫F0 F1 ATP酶复合体， 是一个多组分的复合物。内膜的酶类可以粗略地分为三个大类运输酶类内膜上有许多运输酶类进行各种代谢产物和中间产物的运输；合成酶类内膜是线粒体DNA、RNA和蛋白质合成的场所；电子传递和ATP合成的酶类这是线粒体内膜的主要成分，参与电子传递和ATP的合成。内膜的标志酶是细胞色素氧化酶。内膜是线粒体进行电子传递和氧化磷酸化的主要部位，含有电子传递链中进行氧化反应的蛋白和酶。在电子传递和氧化磷酸化过程中，线粒体将氧化过程中释放出来的能量转变成ATP。膜间隙是线粒体内膜和外膜之间的间隙，宽68 nm， 其中充满无定形的液体，含有可溶性的酶、底物和辅助因子。膜间隙中的化学成分很多，几乎接近胞质溶胶。腺苷酸激酶是膜间隙的标志酶，它的功能是催化ATP分子的末端磷酸基团转移到AMP，生成两分子ADP。膜间隙的功能是建立氢质子梯度。线粒体基质是内膜和嵴包围着的线粒体内部空间是线粒体基质。基质中的酶类最多，与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有关的酶都存在于基质之中。此外还含有DNA、tRNAs、rRNA、以及线粒体基因表达的各种酶和核糖体。基质中的标志酶是苹果酸脱氢酶。线粒体基质的功能是进行氧化反应，主要是三羧酸循环。4. 线粒体内膜的通透性极低， 它是如何进行物质运输的?答: 由于线粒体对于大多数亲水物质的透性极低，所以它必须具备特殊的主动运输系统，完成下列运输作用:糖酵解产生的NADH必须进入电子传递链参与有氧氧化；线粒体产生的代谢物质如草酰辅酶A和乙酰辅酶A必须运输到细胞质中，它们分别是细胞质中葡萄糖和脂肪酸的前体物质;线粒体产生的ATP必须进入到胞质溶胶，以便供给细胞反应所需的能量，同时，ATP水解形成的ADP和Pi又要被运入线粒体作为氧化磷酸化的底物。在线粒体内膜上具有完善的运输系统，主要是运输蛋白和一些起促进运输作用的脂类(如心磷脂)。运输系统也包括参与电子传递和氢质子传递的复合物，内膜上有运输丙酮酸、脂肪酸和特殊氨基酸的运输蛋白，其中某些运输蛋白(包括同向和逆向)是靠质子梯度驱动的。线粒体氧化磷酸化作用所需无机磷(Pi)输入是与线粒体中OH-的输出同时逆向进行的(二者间输入与输出的比值为1:1)。线粒体中由ADP+Pi生成的ATP向细胞质的运送是通过另一种运输蛋白与细胞质中的ADP进行交换完成的，其结果，ATP被运输到胞质溶胶供细胞代谢需要，ADP被运进线粒体基质，与运进的Pi一起参与ATP的合成。这两种逆向运输泵共同维持线粒体基质中高ADP和Pi的浓度。5. 线粒体内膜是如何进行Ca2+运输的?对细胞质中Ca2+浓度调节有何意义? 答: 线粒体内膜上有两种类型的Ca2+运输系统，能够将Ca2+输入到线粒体基质中，或将Ca2+从线粒体基质运输到膜间隙。系统1是由膜动力势引起的Ca2+离子流向线粒体基质;系统2是通过与Na+离子的交换将Ca2+离子输出到胞质溶胶。Ca2+从线粒体膜间隙输入到线粒体基质是由内膜上的膜动力势驱动的(内膜内侧带负电，能吸引正电离子)。Ca2+输入的速率随着外部Ca2+浓度的变化而变化。在心脏、脑和骨骼肌等组织中，Ca2+的输出是由Na+梯度驱动的，即与Na+进行逆向协同运输。在正常情况下，这种交换运输的速度非常之快。因此，线粒体、内质网和肌质网都能作为细胞质中Ca2+调节的缓冲区域。如果胞质溶胶中Ca2+浓度升高，Ca2+输入线粒体的速率提高，而Ca2+输出的速率维持不变，这样导致线粒体基质Ca2+浓度的升高而胞质溶胶中Ca2+浓度下降到原始的浓度水平。反之，胞质溶胶中Ca2+浓度的下降，促使线粒体对Ca2+输入速率的下降，而只有线粒体Ca2+的输出速率不变，最后导致胞质溶胶中Ca2+浓度恢复到一个设定点(set-point)。6. 比较引导序列与信号序列有什么不同? 答: 无论是在游离核糖体合成的蛋白质还是在膜结合核糖体合成的蛋白质，它们的转运都是由信号引导的，这种信号一般存在于蛋白质的N-端，这就是蛋白质的定位信号。由于游离核糖体合成的蛋白质与膜结合核糖体合成的蛋白质的运输信号不同导致运输机制的不同，为了便于区别它们，将游离核糖体上合成的蛋白质的N-端信号统称为导向信号(targeting signal)，或导向序列(targeting sequence)，由于这一段序列是氨基酸组成的肽，所以又称为转运肽(transit peptide)，或导肽(leading peptide)。将膜结合核糖体上合成的蛋白质的N-端的序列称为信号序列(signal sequence)，将组成该序列的肽称为信号肽（signal peptide）。在不需要特别区分时，可将它们统称为信号序列或信号肽。虽然转运到细胞核中的蛋白质也是在游离核糖体上合成的，由于此类蛋白的运输机制特别，所以将这些蛋白中的定位引导序列称为核定位信号(nuclear localization signal， NLS)。7. 线粒体基质蛋白是如何定位的? 答: 定位过程是: 前体蛋白在游离核糖体合成释放之后，在细胞质分子伴侣Hsp70的帮助下解折叠,然后通过N-端的转运肽同线粒体外膜上的受体蛋白识别,并在受体(或附近)的内外膜接触点(contact site)处利用ATP水解产生的能量驱动前体蛋白进入转运蛋白(protein translocator)的运输通道,然后由电化学梯度驱动穿过内膜,进入线粒体基质。在基质中, 由线粒体分子伴侣Hsp70(mHsp70)继续维持前体蛋白的解折叠状态。接着在Hsp60的帮助下,前体蛋白进行正确折叠,最后由转运肽酶切除导向序列,成为成熟的线粒体基质蛋白。8. 从线粒体基质蛋白质的定位,可看出导肽在转运蛋白时具有哪些特点? 答: 线粒体转运肽转运蛋白质时，具有以下特点:需要受体由于被转运的蛋白质需要穿过(或插入)线粒体膜,转运肽首先需要与线粒体膜上的受体识别,然后才能进行转运。从接触点进入 线粒体的内外膜要局部融合形成被运输蛋白进入的接触点(contact site)。蛋白质要解折叠 蛋白质在合成时为了防止降解，需要立即折叠形成空间结构，但是在转运时，必须解折叠，运入线粒体之后再重新折叠，需要能量 转运肽引导的蛋白质转运是一个耗能过程，既要消耗ATP，又要膜电位的驱动。需要转运肽酶由于转运肽只是起蛋白质转运的引导作用，而非蛋白质的永久结构，所以，当蛋白质到达目的地后，转运肽要被切除，是由转运肽酶(transit peptidase)催化的。需要分子伴侣的帮助在线粒体蛋白的转运过程中,至少需要两种类型的分子伴侣的参与,一种是帮助转运的蛋白质解折叠,另一种是将转运的蛋白质重新折叠。9. 葡萄糖在胞质溶胶中进行糖酵解时形成的1分子NADH是怎样被氧化的? 答: 葡萄糖在胞质溶胶中进行糖酵解时形成1分子NADH, 由于胞质溶胶中形成的NADH自身不能进入线粒体,但可通过另外的方式将其电子转移到线粒体并参与电子传递:将电子还原那些小分子的代谢物,这些小分子的代谢物能够:通过苹果酸-天冬氨酸穿梭(malate-aspartate shuttle)进入线粒体,然后将线粒体中NAD+还原成NADH；通过甘油磷酸穿梭(glycerol-phosphate shuttle),将电子传递给线粒体的FAD,使其还原形成FADH2。这些被还原的辅酶通过线粒体内膜的电子传递链最后被传给氧。如在甘油-磷酸穿梭过程中,电子从NADH转移给二羟丙酮磷酸（DHAP）生成甘油-3-磷酸, 甘油-3-磷酸进入线粒体膜间隙后被线粒体内膜中的甘油3-磷酸脱氢酶脱氢,将内膜中FAD还原成FADH2。脱氢的甘油-3-磷酸又穿梭回到胞质溶胶，FADH2在内膜中被氧化。10. 什么是递氢体? 有什么作用? 答: 组成呼吸链的成员中除了电子载体外，有些还具有将质子跨膜传递到膜间隙的作用，通常将能够传递质子的复合物称为递氢体，或称递质子体递。在呼吸链的四个复合物中，复合物、既是电子载体，又是递氢体; 复合物只是电子载体，而不是递氢体。质子从线粒体基质跨膜传递到线粒体膜间隙是一种耗能的过程,递氢体利用电子在呼吸链中传递时释放的自由能完成递氢过程。实际上,正是呼吸链中的递氢体通过对质子的跨膜传递,将NADH和FADH2在氧化过程中释放出来的自由能转变成势能,这种势能可进一步用于ATP 的合成。质子跨过内膜向膜间隙的转运也是一个生电作用(electrogenesis),即电压生成的过程。因为质子跨膜转运使得膜间隙积累了大量的质子,建立了质子梯度。由于膜间隙质子梯度的建立, 使内膜两侧发生两个显著的变化一是线粒体膜间隙产生大量的正电荷，而线粒体基质产生大量的负电荷，使内膜两侧形成电位差；二是两侧氢离子浓度的不同因而产生pH梯度(pH)，这两种梯度合称为电化学梯度(electrochemical gradient)。线粒体内膜两侧电化学梯度的建立，能够形成质子运动力(proton-motive force,p)，只要有合适的条件即可转变成化学能储存起来。11. 化学渗透假说的主要内容是什么?主呼吸链每传递一对电子会将多少氢质子传递到膜间隙?次呼吸链呢? 答: 该学说的主要内容包括:电子传递从NADH开始，复合物将还原型的NADH氧化，释放出的两个电子和一个H+质子被NADH脱氢酶上的黄素单核苷酸(FMN)接受，同时从基质中摄取一个H+ 将FMN还原成FMNH2，NADH被氧化成NAD+重新进入TCA循环;FMNH2 将一对H+质子传递到膜间隙，同时将一对电子经铁硫蛋白(FeS)传递给Q池中的两个辅酶Q;两个辅酶Q得到电子后从基质中摄取两个H+被还原成两个半醌(QH);醌在内膜中通过扩散进行穿膜循环(醌循环)，两个半醌各从细胞色素b获得一个电子，并从基质中再摄取两个H+ 质子，形成两个全醌(QH2);当全醌扩散到内膜外侧时，便把两个电子传递给细胞色素c1，并向膜间隙释放一对H+ 质子，本身又被氧化成半醌;当半醌扩散到接近细胞色素b时，将携带的另两个电子传递给细胞色素b，并又向膜间隙释放一对H+，细胞色素b的一对电子又回到醌循环;细胞色素c1将接受的两个电子经细胞色素c和细胞色素氧化酶传递给氧，将氧还原成H2O;一对电子经呼吸链传递到氧时，共将基质中3对H+ 泵到膜间隙，从而使膜间隙的H+ 浓度高于基质， 因而在内膜的两侧形成了电化学梯度。这种电化学梯度可驱动H+ 通过ATP合酶复合物进入基质， 每通过2个H+ 可产生1个ATP。概括起来.在呼吸链进行的电子传递和质子的传递过程中,每传递一对电子,共传递10个质子,其中2个用于合成水,8个被传递到线粒体膜间隙建立质子梯度。12. 什么是结合改变模型? 答: ATP合酶合成ATP的分子机理的研究一直是研究的热点，为多数人接受的ATP合酶合成ATP的模型是“结合改变模型”。该模型认为F1中的亚基作为C亚基旋转中心中固定的转动杆， 旋转时会引起复合物构型的改变， 有三种不同的构型，对ATP和ADP具有不同的结合能力: O型几乎不与ATP、ADP和Pi结合;L型同ADP和Pi的结合较强;T型与ADP和Pi的结合很紧，并能自动形成ATP，并能与ATP牢