纤维蛋白原对牙龈卟啉单胞菌黏附口腔上皮细胞的影响.pdf

牙周病学研究 基金项目 国家自然科学基金资助项目 30471890 作者单位 610041 成都 四川大学华西口腔医 学院牙周科 葛颂 吴亚菲 口腔内科教研室 刘天佳 赵蕾 费晓露 通讯 作者 吴 亚菲 Emai lyafeiwu tom com 电 话 028 85501471 纤维蛋白原对牙龈卟啉单胞菌黏附 口腔上皮细胞的影响 葛颂 吴亚菲 刘天佳 赵蕾 费晓露 摘要 目的 探讨血浆蛋白成分纤维蛋白原 Fg 在牙周病发病机制中的作用 方法 体外 培养口腔上皮细胞系 KB细胞至单层融合 分别与不同浓度 Fg溶液共同孵育 并加入以 3H 胸腺嘧啶 核苷标记的牙龈卟啉单胞菌 Pg 行细菌感染攻击细胞实验 采用同位素闪烁光谱测定法检测黏附 和内化于 KB细胞的 Pg数量 结果 加入 Fg的各实验组黏附和内化细菌量及细菌黏附和内化率均 显著高于未加入 Fg的对照组 不同 Fg浓度的各组间黏附和内化细菌量及黏附和内化率差异亦有统 计学意义 随着 Fg浓度的升高 黏附和内化的细菌量显著增加 结论 纤维蛋白原可促进 Pg黏附于 口腔上皮细胞 在牙周病的发生 发展中可能具有一定的病理学作用 关键词 纤维蛋白原 紫单胞菌 龈 细菌黏附 牙周病学 Effect of fibrinogen on the adherence of Porphyromonas gingivalis to hum an oral epithelial cells GE Song WU Ya fei LIU Tian jia ZHAO Lei FEIX iao lu Departmentof Periodontology WestChina School of Sto matology Sichuan University Chengdu 610041 China Corres ponding author WU Ya fei Email yafeiwu to m co m T el 028 85501471 Abstract Objective To study the role of fibrinogen molecule in the pathogenesis of periodontal diseases M ethods An in vitro cell culture model was used M ethyl 3H Thym idine radiolabeled Porphyro monas gingivalis Pg ATCC 33277 were exa m ined for their ability to adhere to and invade the confluentmonolayers of human oral epithelial KB cells w ith or w ithout exogenous human fibrinogens by scintillation spectrometry Results The addition of exogenous fibrinogensmade more a mount of and higher ratios of adhesive and invasivePg in contrast to the group without exogenous fibrinogen P 0 001 A t different concentrations of exogenous fibrinogen the a mount and ratios of adhesive and invasive Pg varied significantly P 0 007 The higher concentrations of exogenous fibrinogenwas added the greater a mount and ratios of adhesive and invasivePg were found Conclusions F ibrinogen promotes the adherence ofPg to humanoralepithelialcellsandmayplayani mportantroleinthepathogenesisof periodontaldiseases Keywords Fibrinogen Porphyro monas gingivalis Bacterial adhesion Periodontics 牙周菌斑生物膜中的细菌是牙周炎的始动因 子 细菌对组织和细胞的黏附是其定植 入侵并建立 感染的先决条件 研究表明 多种胞外糖蛋白成分 可能起着桥梁分子的作用 介导细菌对组织和细胞 的黏附 纤维蛋白原 fibrinogen Fg 即凝血因子 是血浆中含量最丰富的蛋白质之一 原核细胞和 真核细胞均可与之结合 1 Lantz等 2 认为 Fg可 以作为细菌定植的支持性基质 细菌与 Fg间的相互 作用具有潜在的病理学意义 牙龈出血是牙周炎症 的典型临床表现 也使得龈沟液中存在大量 Fg 可 能为牙周致病菌的黏附与定植提供桥梁分子 我们 通过观察 Fg对牙周主要致病菌牙龈卟啉单胞菌 Porphyromonas gingivalis Pg 黏附口腔上皮细胞 的影响 探讨了 Fg在牙周病发病机制中的作用 材料和方法 1 主要材料与仪器 Pg 菌株 ATCC33277 口 腔生物医学工程教育部重点实验室提供 人口腔 上皮细胞 KB细胞株 ATCC CCL17 华神集团成都 研究中心 人 Fg F3879 Sigma 美国 DMEM 高 糖 培养基及胎牛血清 fetal bovine serum FBS 69 中华口腔医学杂志 2006年 2月第 41卷第 2期 Chin J Stomato l February 2006 Vol 41 N o 2 Hyclone 美国 甲基 3H 胸腺嘧啶核苷 3H TdR 中科院上海原子核研究所 细胞活力分析仪 V i Cell Beck m an Coulter 美国 比浊仪 BD Crystal Spec TM 美国 CO 2恒温孵箱 H epa F ilter 美国 厌 氧培养箱 金钟 DY 2型 浙江 液体闪烁计数器 FJ 2107P 西安 2 方法 1 PgATCC33277的培养和 3H TdR标记 取厌 氧血琼脂平板培养之 PgATCC33277接种至 15 m l 牛心脑浸液 培养基 含 5 mg L 氯化 血红素和 1 mg L维生素 K3 37 厌氧 80 N2 10 H2 10 CO2 培养 24 h 取少量细菌悬液涂片 革兰染 色 镜检证实为 Pg 纯培养 图 1 后 加入 3H TdR 3 7 10 8 Bq L 继续厌氧培养 24 h后用于黏附 分析 2 人口腔上皮 KB细胞的培养 将冻存之 KB 细胞复苏并移入底面积为 25 mm 2 的培养瓶 培养 液为含 10 FBS的 DMEM 37 5 CO2孵育 培养 并传代 待 KB细胞呈多角形 LSD 法多 重比较结果 图 4 显示 加入 Fg的各实验组黏附和 内化细菌量及细菌黏附和内化率均显著高于未加入 Fg的对照组 P 0 001 而不同 Fg浓度各实验组 黏附和内化细菌量及黏附和内化率间差异亦有统计 学意义 P 0 007或 P 0 004或 P 0 001 随 Fg浓度的升高 黏附和内化的细菌量增加 表 1 不同浓度 Fg对 Pg黏附 KB细胞的影响 x s Fg浓度 g L n 黏附和内化细菌量 107CFU 细菌黏附和 内化率 060 236 0 0752 362 0 748 161 130 0 11811 298 1 185 361 515 0 12515 152 1 254 1062 579 0 37625 788 3 763 3062 997 0 28529 973 2 851 70 中华口腔医学杂志 2006年 2月第 41卷第 2期 Chin J Stomato l February 2006 Vol 41 No 2 各组与 0 g L组比较 P 0 001 3 g L 组与 1 g L 组比 较 P 0 007 10 g L 及 30 g L 组与 1 g L组比较 P 0 001 10 g L及 30 g L组与 3 g L 组比较 P 0 001 30 g L 组与 10 g L组比较 P 0 004 图 4 不同浓度 Fg对 Pg黏附 KB细胞的影响 讨论 细菌对组织和细胞的黏附是其定植 入侵并建 立感染的先决条件 Fg是血浆中含量最丰富的大 相对分子质量的糖蛋白之一 肝脏是产生 Fg的主 要部位 但 Fg也可由牙龈上皮细胞和成纤维细胞等 合成 并与纤维黏连蛋白 层黏连蛋白 透明质酸等 协同 构 成 细 胞 外 基 质 4 金 黄 色 葡 萄 球 菌 Staphylococcus aureus S aureus A和 B族链球菌 白假丝单胞菌 鼠肝细胞 培养的内皮细胞及血小板 等许多原核和真核细胞均可特异地与 Fg结合 1 Lantz等 2 认为 Fg可作为细菌定植的支持性基质 而且以二聚体形式存在的每个 Fg分子可结合多个 菌细胞 为细菌间的相互集聚提供了媒介 Cheung 等 5 的研究证实 Fg可作为桥梁分子介导 S aureus 对人内皮细胞的黏附 Fg是促进这种黏附作用的 必须介质之一 Kanzaki等 6 发现 Fg 在 S aureus 对小鼠表皮角质层的黏附中也发挥重要作用 Pg是目前公认的牙周炎主要致病菌 其毒力因 子菌毛和牙龈素与 Pg黏附和入侵牙龈上皮细胞有 关 7 8 Amano等 9 研究发现 Pg 菌毛可与 Fg特 异 高亲和性地结合 利于细菌侵入牙周组织 对其 感染的建立至关重要 I mamura 10 的研究表明 精 氨酸特异性牙龈素 Arg gingipain Rgp 和赖氨酸特 异性牙龈素 Lys gingipain Kgp 均可特异 高亲和 性地与 Fg结合 高相对分子质量的 RgpA和 Kgp与 Fg的结合部位是其血凝素 黏附结构域 牙周组织 炎症 出血使龈沟液中存在大量 Fg 可能为 Pg等的 黏附与定植提供桥梁分子 本研究结果显示 与未 加入 Fg的对照组相比 加入外源性 Fg后 Pg 对口 腔上皮细胞系 KB细胞的黏附与内化显著增加 P 0 001 细菌黏附量与黏附率约增加 5 12倍 初 步证实了 Fg在介导 Pg黏附 KB细胞过程中的桥梁 作用 急性期反应是微生物感染 损伤 坏死 炎症以 及恶性肿瘤等导致机体发生的早期 复杂的生理和 代谢改变 在急性期 Fg血浆水平可升高 2 10倍 牙周细菌和促炎细胞因子的刺激作用可引发机体急 性期反应 造成 Fg合成增加 水平升高 而高水平的 Fg又可能促进牙周致病菌黏附 定植 从而形成恶 性循环 本研究结果也表明 实验组不同浓度 Fg对 Pg黏附 KB细胞的促进作用有显著差异 随着加入 Fg浓度的升高 其促进黏附的作用也显著增加 Fg 的正常血浆浓度为 2 4 g L 但 Carl n等 11 认为 龈沟液中 Fg浓度较低 约为其血浆浓度的 1 2 这 也是本研究实验组 Fg浓度选择的依据 此外 研究发现 除 Pg外 福赛拟杆菌 中间普 氏菌等牙周致病菌均具有结合并降解 Fg的能力 且 每个菌细胞具有数百到上千个不等的 Fg结合位 点 2 10 12 这些特点使牙周致病菌可通过黏附在覆 以 Fg的生物表面定植于宿主组织 降解 Fg使细菌 可与靶蛋白脱黏附以侵入深部组织 并使感染播散 同时 表面覆以 Fg的细菌又使之可能逃避宿主的免 疫识别 Walzog等 13 研究表明 Fg可通过 2整合 素与中性多形核白细胞结合并促进其 IL 1 和 I L 8 的分泌 可见 Fg在牙周病发生发展中的病理作用 不容忽视 值得一提的是 近年来大量的研究表明 牙周病与心血管疾病 cardiovascular disease CVD 的发生高度相关 14 而血浆 Fg水平升高与 CVD 的发生密切相关 是 CVD的重要独立危险因素 Fg 可否成为联系牙周病与 CVD的纽带 能否通过积极 的牙周治疗控制炎症反应 降低牙周和血浆 Fg水 平 进而预防和控制 CVD的发生 以及 Fg在牙周病 发病机制中的其他可能作用 尚待进一步研究 参考文献 1 Doolittle RF F ibrinogen and fibrin Annu Rev Biochem 1984 53 195 229 2 Lantz MS A llen RD Bounelis P et al Bactero ides g ingivalis and Bacteroidesinter mediusrecognizedifferentsitesonhuman fibrinogen J Bacterio l 1990 172 716 726 3 Park Y Y il maz O Jung I Y et al Identification of Porphyromonas g ingivalis genes specifically expressed in human g ingival epithelial 71 中华口腔医学杂志 2006年 2月第 41卷第 2期 Chin J Stomato l February 2006 Vol 41 N o 2 cells by using differential display reverse transcription PCR I nfect I mmun 2004 72 3752 3758 4 SahingurSE Shar ma A G enco RJ et al Association of increased levels of fibrinogen and the 455G A fibrinogen gene polymorphism w ith chronic periodontitis J Periodonto l 2003 74 329 337 5 Cheung AL K rishnan M Jaffe EA et al F ibrinogen acts as a bridg ing moleculein the adherence of Staphy lococcus aureus to cultured human endothelial cells J C lin Invest 1991 87 2236 2245 6 Kanzaki H M orishita Y Akiyama H etal Adhesionof Staphylococcus aureus to horny layer role of fibrinogen J Der matol Sc i 1996 12 132 139 7 Umemoto T H amada N Characteriztion of biologically active cell surface components of a periodontal pathogen The ro les ofma jorand minor fi mbriae of Porphyromonas g ingivalis J Periodonto l 2003 74 119 122 8 Chen T Nakayama K Belliveau L et a l Porphyromonas g ingivalis ging ipains and adhesion to epithelial cells Infect I mmun 2001 69 3048 3056 9 Amano A Nakamura T K i mura S et al M olecular interactions of Porphyromonas gingivalis fi mbriaew ith host proteins kinetic ana lyses based on surface plas mon resonance Infect I mmun 1999 67 2399 2405 10I mamura T The role of gingipains in the pathogenesis of periodontal disease J Periodonto l 2003 74 111 118 11 Carl n A R diger SG Loggner I et al Bacteria binding plasma proteins in pellicles for med on hydroxyapatite in vitro and on teeth in v ivo OralM icrobio l I mmuno l 2003 18 203 207 12 Honma K Kuramitsu HK Genco R J et al Development of a gene inactivation systemfor Bactero ides forsythus constructionand characterization of a BspA mutant Infect I mmun 2001 69 4686 4690 13 W alzog B W einmann P Jeblonski F et al A ro le for beta 2 integrins CD11 CD18 in the regulation of cytokine gene expression ofpo lymorphonuclearneutrophilsduringtheinflammatory response FASEB J 1999 13 1855 1865 14 M eur man J H Sanz M Janket SJ Ora l health atherosclerosis and cardiovascular disease Crit Rev O ral BiolM ed 2004 15 403 413 收稿日期 2005 06 23 本文编辑 孔繁军 病例报告 图 1 3 5岁时曲面断层片 显示乳牙牙槽骨严重吸收 图 4 5 5岁时曲面断层片 显示遗留乳牙牙槽骨严重吸收 图 9 16岁 10个月时 曲面断层片 显示除第一恒磨牙的牙槽骨有吸收外 全