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实验四 转氨基作用（纸层析法）原理氨基酸分子上的氨基转移到-酮酸分子上的反应过程称为转氨基作用（或称氨基移换作用）。转氨基作用是氨酸代谢的重要反应之一，由转氨酶催化。经转氨后，原来的-氨基酸变成了相应的-酮酸，原来的-酮酸则成为新的、相应的-氨基酸。本实验观察谷氨酸与丙酮酸在肌匀浆中的谷氨酸丙酮酸转氨酶（简称GPT）的催化进行转氨基的过程。然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。为便于观察转氨基作用，在反应中须加一碘醋酸（或溴醋酸），以抑制谷氨酸和丙酮酸的其它代谢过程。试剂10.9% NaCl溶液。2PH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液81ml与0.2mol/LNaH2PO4溶液19ml混匀，稀释至2000ml。31%谷氨酸钾溶液：取谷氨酸1g ，加水20ml，用5%KOH调到中性，然后用pH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液稀释至100ml。41%丙酮酸钠溶液：取丙酮酸1g加pH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲溶液溶解成100ml。50.25%一碘酸钠溶液：取一碘醋酸0.25g加水1ml，用5%KOH调到中性，然后加pH7.4，0.01mol/L磷酸缓冲液成100ml。（一碘醋酸可用一溴醋酸代替）。62%HAc操作1肌匀浆的制备（由实验室准备室制备）取小白兔一只，猛击头部处死后，立即剪颈放血，取肌肉若干经0.9%NaCl溶液洗去血污后，称取肌肉约100g置电动匀浆器中，再加0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液500ml磨成匀浆。2.转氨基反应：取小试管2支编号，所加试剂以滴为单位。编 号试 剂12肌匀浆1010将2号管置沸水浴中5分钟，然后取出冷却1%谷氨酸钾10101%丙酮酸钠10100.25%碘醋酸钾55混匀后同置40水浴中保温45分钟（或60分钟）。在保温过程中，时加振摇。取出两管各加入2%醋酸2滴，再同置沸水浴中5分钟，使蛋白质完全凝固，冷却后，离心（200r/min）5分钟，（或静置10分钟），将上清液作氨基酸的纸层析。附 氨基酸的纸层析原理层析法又称色层分离法，原指有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法。后来此方法也应用于无色物质的分离。层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析、分配层析和亲和层析等。纸层析是分配层析中的一种。分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用a表示分配系数。溶质在固定相中的浓度（Cs）a= 溶质在流动相中的浓度（CL）一种物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。纸层析是以纸作为惰性支持物的分配层析，纸纤维上的羟基具有亲水性，因此以滤纸吸附的水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂沿着滤纸自下而上流动的，称为“上行法”；自上而下流动的，称为“下行法”。将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展开，样品中的种种溶质（如各种氨基酸）即在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同的溶质随流动相移动的速率不等，于是就将这些溶质分离出来，形成距原点不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示；原点到层析点中心的距离Rf=原点到溶剂前沿的距离只要条件（如温度、展开溶剂的组成、滤纸的质量等）不变，Rf值是常数。故可根据Rf值作定性分析。层析后，各种溶质在滤纸上的位置可用适当的化学或物理方法处理而使其显示出来。对于氨基酸常用茚三酮使之显色。试 剂1饱和水的酚：取 50 g重蒸馏酚（隔水加热溶化，量取50ml。）与25ml水，在分液漏斗中充分混匀，于暗处放置过夜（710小时），分成两层，收集下层清液放入棕色瓶中保存。注意：在重蒸馏和移取酚时，务必防止溅在皮肤上，若溅在皮肤上，立即用70%酒精擦洗，以免腐蚀皮肤。20.10.25% 茚三酮丙酮（或乙醇）溶液。30.1 谷氨酸溶液：将转氨基作用实验中的试剂3，用pH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液稀释10倍。40.1丙氨酸溶液：取丙氨酸用pH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液配制。操作1向层析缸中装入饱和水的酚（其深度约1.5cm）。2取宽 4.5cm，长18cm滤纸一条，（手指不可接触纸面）在滤纸条一端 2cm处划一水平线（原线），在此线上以间隔相等的距离用铅笔画四个直径约24mm的小圆圈，标明号码。3用毛细管向各小圈中央点上各种不同的氨基酸溶液，并记录之。例如：第一点为谷氨酸，第二点为丙氨酸，第三点及第四点为转氨基作用实验中的1号及2号试管溶液。点样直径以3mm为宜。4待干燥后可重复点样一、二次，再干燥。然后将此纸条插入上述准备好的层析缸中。先将纸条悬挂于玻璃缸内的横玻棒上（或用棉线代替），调节其高度，使纸条的下端浸入酚内约 1 cm ( 勿使氨基酸小点与溶剂直接接触)，然后把盖盖紧。（如图20所示）。 图20上行法纸层析5经11.5小时，当溶剂上升至约1015 cm高时，取出滤纸，置烘箱烘干或用电吹风吹干，使酚蒸发。6将已烘干的滤纸浸入茚三酮酒精溶液，再置干燥箱中烘干（或用电吹风吹干），这时在纸的不同位置上，可见紫红色的斑点出现，用铅笔描绘溶剂前沿和斑点的中心位置。结果计算出各氨基酸的Rf值。附注1纸层析法不仅可以用于氨基酸的分离和定性，还可以用于定量测定（把紫色斑点剪下来，用硫酸铜乙醇溶液洗脱下来比色），更可以应用于糖、维生素、抗菌素、有机酸等小分子物质的分离和分析。2各种氨基酸在同一实验条件下（即相同的溶剂、温度、滤纸质量）各有其特有的、不变的Rf值，这是我们鉴定氨基酸