肝内胆管结石并肝内胆管癌.doc

肝内胆管结石并肝内胆管癌组织中HSP27和Caspase-9的表达及与凋亡的关系【摘要】目的：探讨肝内胆管结石并肝内胆管癌组织中HSP27和Caspase-9的表达及与凋亡的关系。方法：选取我院于2010年10月至2013年10月间收集的病例资料和手术切除标本60例作为研究对象，并将其分为三组，A组正常胆管组12例，B组肝内胆管结石组28例，C组肝内胆管结石并肝内胆管癌组20例。通过免疫组织化学法分别对三组的HSP27与Caspase-9 的表达情况进行检测，并研究分析HSP27和Caspase-9与细胞凋亡之间的关系。结果：三组标本的HSP27和Caspase-9的表达阳性率分别为0、32.14%（9/28）和75.00%（15/20），C组明显高于其他两组(P0.05)，肝内胆管结石并肝内胆管癌组织中，HSP27和Caspase-9的表达呈负相关关系（r=-0.378，P=0.020）；三组的凋亡指数（apoptosis index，AI）分别为12.652.16%、14.263.77%、3.682.71%，A、B两组的 AI值明显高于C组P0.05）结论： HSP27的高表达或 Caspase-9的低表达都更容易造成淋巴结转移或门静脉浸润的现象，Hsp27能够通过抑制Caspase-9的活性从而抑制细胞凋亡。【关键词】肝内胆管结石；肝内胆管癌组织；表达与凋亡Expression of HSP27 and Caspase-9 and its relationship to apoptosis in hepatolithiasis associated intrahepaticAbstract Objective: To investigate the expression of HSP27 and Caspase-9 and its relationship to apoptosis in hepatolithiasis associated intrahepatic. Methods: The clinical data of 60 cases between October 2010 to October 2013 was analyzed in our hospital, and the 60 cases were divided into three groups, A group:normal bile duct group (12 cases), group B:liver group with bile duct stones (28 cases ), group C:group with intrahepatic bile duct stones intrahepatic cholangiocarcinoma (20 cases ). HSP27 expression and Caspase-9 of three groups were detected by immunohistochemistry, respectively, and to study and analyze the relationship between HSP27 and apoptosis Caspase-9 between. Results: HSP27 and positive expression rate of the three groups of specimens Caspase-9 was 0,32.14% (9/28) and 75.00% (15/20), respectively, group C was significantly higher than the other two groups (P 0.05).The expression of HSP27 and Caspase-9 was negatively correlated with liver bile duct stones and intrahepatic cholangiocarcinoma tissues, (r = -0.378, P = 0.020); three groups of apoptotic index (apoptosis index, AI) was 12.65 2.16 %, 14.26 3.77%, 3.68 2.71%, AI value of group A and B was significantly higher than group C P 0.05）。免疫组化半定量诊断标准按无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色等四种类别分别记为03分；按占切片总细胞数的比例分别记为04分。将两项分数相乘，所得积分为四个几倍，0分为“-”阴性，l-4分为“+”弱阳性，5-8分为“+”阳性，9-12分为“+”强阳性。1.1.2实验试剂与实验仪器 羊抗人HSP27免疫组化多克隆抗体(ZS-1048，浓缩型0.1ML)、兔抗人Caspase-9免疫组化多克隆抗体(ZS-8355，浓缩型0.1ML)、即用型免疫组化试剂盒等购于南京碧波生物技术有限公司。其他试剂包括纯二甲苯、PBS 缓冲液、苏木素复染液等取自于我院中心试验室。 主要实验仪器包括光学显微镜 BX60、生物组织自动包埋机（TB-718D2）、切片机（AS325）、全自动生物组织脱水机（ZT-12J）、病理组织漂烘仪（PHY-）、染色架、微量移液器、YPS 病理图文分析管理软件等，取自于我院中心试验室。1.2方法 免疫组织化学检测(SP法)的具体步骤如下，首先将4m厚的石蜡标本块经过连续切片处理后，将其放置在温度为60恒温箱中进行烤片30min；然后将常规纯二甲苯溶液依次经不同浓度的梯度酒精水化各5min，再以PBS缓冲液进行漂洗处理；使檬酸盐缓冲液进经微波抗原修复，在高火档微波内持续复原10分钟，在保证切片快速冷却后再及时取出，并置于37C的恒温箱中30min；向切片滴加羊抗人 HSP27免疫组化多克隆抗体和兔抗人 Caspase-9免疫组化多克隆抗体后置于恒温为4的冰箱过夜；第二天经PBS缓冲液冲洗后进行二次滴加，以苏木素复染2min后观察结果，对图像进行采集。 TUNEL细胞凋亡原位检测的具体步骤与SP法的具体步骤相类似，石蜡切片经过滴加蛋白酶K工作液后置于37C的恒温箱中30min，以PBS缓冲液漂洗之后，将切片浸入封闭液中。再讲切片取出，周围用滤纸吸干，滴加50ul的TDT酶反应液，以荧光显微镜来观察并计数细胞的凋亡情况，对图像进行采集。1.3统计学处理 应用SPSS17.0软件，HSP27、Caspase-9 的表达关系用2检验；凋亡指数用均数标准（xs）表示，组间比较用t检验、多个样本均数的比较采用方差分析；规定P0.05 为差异显著，具有统计学意义2。2.结果2.1 HSP27与Caspase-9 在不同胆管组织中的表达 三组中HSP27的表达阳性率分别为0、32.14%（9/28）和75.00%（15/20）。C组HSP27的蛋白表达主要定位于细胞浆，染色呈棕黄色或黄色。本研究中20例肝内胆管癌组织有15例 HSP27蛋白表达呈阳性，明显高于A、B两组，差异显著，具有统计学意义(P0.05)。具体详见下表1。表1 HSP27 在不同胆管组织中表达情况对比组别例数HSP27阳性率-+A组12120000.00%B组281954032.14%C组20538475.00% 三组中Caspase-9 的表达阳性率分别为83.33%（10/12）、71.43%（20/28）和30.00%（6/20）。Caspase-9的蛋白表达主要定位于细胞浆，染色呈棕黄色。本研究中20例肝内胆管癌组织的胞浆中仅有6例表达呈阳性，明显低于A、B两组，差异显著，具有统计学意义(P0.05)。具体详见下表2。表2 Caspase-9 在不同胆管组织中表达情况对比组别例数Caspase-9阳性率-+A组12235283.33%B组288610471.43%C组201442030.00%C组患者的HSP27 与Caspase-9 蛋白表达的相关性经Pearson 相关性分析，结果见表3，呈负相关表3 HSP27、Caspase-9 与肝内胆管结石并肝内胆管癌的相关性HSP27例数Caspase-9阳性阴性例数百分率（%）例数百分率（%）阳性15213.331386.67 阴性5480.00120.00合计20630.001470.00注：Pearson分析（r=-0.378，P=0.020）。2.2三组凋亡指数比较在正常胆管组12例、肝内结石所在胆管组28例、肝内胆管结石并肝内胆管癌组20例组织中，A、B两组的 AI值明显高于C组，差异显著，具有统计学意义（P0.05）。具体各组凋亡指数详见下表4。表4 细胞凋亡在不同胆管组织之间的对比组别例数细胞凋亡指数（%）A组1212.652.16B组2814.263.77C组203.682.713.讨论 肝胆管结石病是临床诊治中常见的疾病，该疾病经过一系列病理变化之后导致癌变，严重影响着患者的生命安全。目前学界对于肝内胆管结石患者发生胆管癌比率的研究存在着不同的看法，一般认为，长期肝内胆管结石患者，尤其是肝胆管结石反复发作的患者，其胆管癌发生几率较高。传统的影像学检查、B超监测及CT均难以发现肝内胆管癌的具体症状2-3。而在临床上怀疑患有肝内胆管癌的患者往往存在着胀痛、肝功能不全等症状，严重影响肝内胆管结石的治疗进程。因此，对肝内胆管结石并肝内胆管癌进行及时诊断与治疗研究是当前临床防治工作的重点和核心问题4-6。HSP27的表达效果与人体恶性肿瘤的产生发展有着密切关系，通过诱导HSP表达，能够促使HSP的调控与应激机能保持细胞生长信号的畅通，在鼻塞死亡受体信号通路及线粒体通路的基础上达到抑制肿瘤细胞凋亡的效果。Caspase-9属于级联反应上游的半胱氨酸蛋白酶，它通过激活凋亡始动因子从而放大细胞级联反应，从而有效促使细胞凋亡7。本研究中20例肝内胆管癌组织有15例 HSP27蛋白表达呈阳性，6例肝内胆管癌组织的胞浆的Caspase-9表达呈阳性。这说明，HSP27和Caspase-9的表达在肝内胆内管癌组织中呈负相关关系。这提示我们在长期肝胆管结石患者的临床诊治工作中应当建立健康档案，将Hsp27和Caspase-9作为肿瘤相关标记物，从而有效指导医师的诊断和治疗工作，这一结论与相关文献报道相一致8-10。综上所述，在肝内胆管结石并肝内胆管癌组织中，HSP27和Caspase-9的表达呈负相关关系；HSP27的高表达或 Caspase-9的低表达都更容易造成淋巴结转移或门静脉浸润的现象，Hsp27能够通过抑制Caspase-9的活性从而抑制细胞凋亡。【参考文献】1朱晓东,林庚金,钱立平.凋亡通路及其调控研究进展J.国外医学、生理、病理科学与临床分册,2012,22(3)：248-251.2 Ke-Lei Zhu,Ding-Yao Li,Cun-Bing Jiang et al.Primary squamous cell carcinoma of the liver associated with hepatolithiasis: A case report.J.World journal of gastroenterology,2012,18(40):5830-5832.3林国乐,赵玉沛,张家敏,等.肝胆管结石合并胆管癌(附16例报告)J.中华肝胆外科杂志,2013,6(3):183-186.4 Inoue,M.,Ajioka,Y.,Wakai,T. et al.Liver-intestine cadherin in intraepithelial neoplasia of intrahepatic cholangiocarcinomaJ.Hepato-gastroenterology,2011,58(112):2045-2051.5 Yu TH,Yuan RH,Chen YL et al.Viral hepatitis is associated with intrahepatic cholangiocarcinoma with cholangiolar differentiation and N-cadherin expression.J.Modern pathology,2011,24(6):810-819.6 Peng NF,Li LQ,Qin X et al.Evaluation of risk factors and clinicopathologic features for intrahepatic cholangiocarcinoma in Southern China: a possible role of hepatitis B virus.J.Annals of surgical oncology,2011,18(5):1258-1266.7 Pandurangan, Muthuraman,Jeong, Dawoon,Amna, Touseef et al.Co-culture of C2C12 and 3T3-L1 preadipocyte cells alters the gene expression of calpains, caspases and heat shock proteinsJ.In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal,2012,48(9):577-582