紫花苜蓿对铅污染土壤修复能力及其机理的研究.doc

紫花苜蓿对铅污染土壤修复能力及其机理的研究叶春和* Email:（济南大学地理系 250022, 济南）摘要 以10mmol/L Pb(NO3)2处理紫花苜蓿幼苗10d，分析了Pb在紫花苜蓿幼苗根、茎、叶中的积累情况、Pb在根表皮细胞中的亚细胞区域化特点及Pb在紫花苜蓿体内的主要存在形式。结果表明，Pb在紫花苜蓿幼苗中积累量（M）特点为：M根M茎M叶。同时X-ray微区分析显示，胞间隙是紫花苜蓿积累Pb浓度最高的部位，细胞壁和液泡次之，胞质中最低。Pb的存在形式分析表明Pb在紫花苜蓿体内主要以难溶的形式存在，另外BSO能够加剧Pb污染对紫花苜蓿幼苗Pn和生长的抑制作用，表明紫花苜蓿对Pb的耐受与植物络和素的形成有关。这些都表明紫花苜蓿对Pb具有一定的耐受机制，避免其对胞质代谢的毒性。同时紫花苜蓿具有很高的生物量和对Pb较高的富集作用，因此是一种很有利用价值的土壤铅污染修复植物。关键词 土壤修复 紫花苜蓿 X-ray微区分析随着世界人口的快速增长和工业的迅猛发展，土壤这一人类赖以生存的必需资源正承受着越来越大的压力。因受到工业三废和农用化学品以及矿区的污染，有相当数量农田的土壤质量日趋下降。在我国由于重金属污染而引起的粮食减产达1000万吨/年，直接经济损失达100多亿元。在西方发达国家和其他发展中国家也存在着类似的问题。土壤修复问题受到人们越来越多的关注，在部分西方国家土壤修复正发展成为一个新兴的环境产业。1998年9月，第16届国际土壤学大会在法国Motepellier召开，土壤修复问题成为大会的一个热点。2000年10月第一届土壤修复国际学术会议在中国杭州召开。对重金属污染土壤修复的措施主要包括物理、化学和生物学措施（bioremediation）。其中物理和化学措施主要是通过降低有重金属（Pb、Cd、Cu、Zn等）的可溶性和生物可获得性（bioavailability），从而减小其毒害作用。近年来，土壤修复研究中生物学措施(主要是植物修复技术：phytoremediation)以其过程简单、成本低廉和不存在安全隐患等特点受到了人们越来越多的关注，在这一方面已有很多成功的例子1、2、3，即通过对特定重金属具有超富集作用的植物从被污染土壤中吸取（phytoextract）重金属离子从而减少其在土壤中的含量，达到土壤修复（remediation）的目的。植物修复技术是一种很有潜力、正在发展的环境修复技术，也是一门正在崛起并涉及土壤学、植物学、环境工程等多门学科的新兴边缘学科4。已有报道紫花苜蓿（Medicago sativa L.）对镍和铜离子具有较高的富集作用，是一种很有应用前景的土壤修复植物5、6、7。但就其对铅的富集能力和机理问题尚缺少全面的研究，基于此，本文研究了Pb(NO3)2处理下紫花苜蓿幼苗体内铅的积累、亚细胞分布、结合形态和Pb污染环境下BSO(buthionine sulfoximine, 一种植物络合素的合成抑制剂)对紫花苜蓿光合作用和生长的效应，以期就紫花苜蓿对铅的富集能力和机理进行初步的探讨。1 材料与方法1.1 植物材料和污染处理将紫花苜蓿(Medicago sativa L.)种子（采自山东省陵县）播种于装有洗净细砂的花盆（直径20 cm，高25cm）中。萌发后，每天浇灌Hoagland营养液一次。长出三个复叶后选择生长一致的健壮幼苗每盆保留10株。在第10片复叶出现时，用10 mmol/L Pb(NO3)2溶液处理紫花苜蓿幼苗，每天浇灌两次，早晚各一次。每个处理6个重复。处理10 d后，取样测定各项指标。1.2 试定内容和方法1.2.1 光合速率的测定以美国产Li-6400便携式光合仪测定紫花苜蓿幼苗叶片的净光合速率(Pn)，光强为1600 Lx，温度为32。1.2.2 紫花苜蓿幼苗体不同部位Pb含量的分析 收获整株植物，用蒸馏水冲洗干净，以吸水纸吸干其表面水分，小心分成根、茎以及叶片三部分，放入120烘箱中杀青后，以85恒温烘干24 h，称重后，取少量放入马伏炉中510灰化12 h，室温冷却后用一滴浓HNO3消化，以去离子水定容至500ml后，用日立Z-8000原子吸收光谱仪测定溶液的Pb含量。1.2.3 Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮细胞中的微区分布将制备好的切片在配有EDAX-9100能谱仪的日立H-800型透射电镜下进行测定，加速电压为150 KV，取出角为25，样品的测量计数时间为60 s，测出的数值分别表示扣除背底后的每种元素的X-ray计数值（CPS）。在检测时，对每一组织区域所测定的微区，至少测试30个点，求出其平均值8。1.2.4 紫花苜蓿幼苗根和叶片中Pb的化学形态分析用逐步提取法研究紫花苜蓿幼苗根和叶片中Pb的化学形态9。提取剂及提取顺序为80%乙醇、去离子水、1 mol NaCl溶液、2%醋酸、0.6 mol盐酸。分别称取4.000 g紫花苜蓿幼苗根和叶片新鲜样品，剪成的碎片，置于烧杯中，加入37.5ml提取剂，在30恒温箱中放置过夜，次日回收提取液，再加入同样体积该提取液，侵取2 h后再回收提取液，重复2次，即在24 h内提取4次，集4次提取液（共150 ml）于烧杯中。提取液经蒸发近干后，用一定比例硝酸-高氯酸消化，用10%硝酸定容，用日立Z-8000原子吸收光谱仪测定溶液中Pb的含量。80%乙醇提取以硝酸盐、氯化物为主的无机盐以及氨基酸盐等;去离子水提取水溶性有机酸盐、重金属的一代磷酸盐等;1mol NaCl 溶液提取果胶酸盐、与蛋白质结合态或吸着态的重金属等;2%醋酸提取难溶性的重金属磷酸盐等;0.6 mol盐酸提取草酸盐等。2 实验结果2.1 Pb污染对紫花苜蓿幼苗体内Pb水平的影响紫花苜蓿幼苗在以含有10mmol/LPb(NO3)2的Hoagland培养液处理10 d后，其根、茎以及叶片内的Pb水平极显著升高，而根部比其它部位积累的多，具体地说，根中Pb水平分别是茎的22.43倍，叶片的35.466倍。（表1）表1. Pb在紫花苜蓿幼苗不同部位中的含量Table 1. Pb contents in different parts of M. sativa seedlings处理紫花苜蓿不同部位中的Pb含量（g/g DW） 根 茎 叶对照 15.31 20.34 16.1710mmol/LPb 12134.21 541.08 342.172.2 Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮细胞中的微区分布用X-ray分别测定了紫花苜蓿幼苗根表皮细胞的细胞壁、细胞质、液泡以及细胞间隙中的Pb相对含量。结果表明，对照植株根细胞及细胞间隙中的Pb含量可能太低而没有测出。但是Pb处理的紫花苜蓿幼苗根细胞的细胞壁、细胞质、液泡和细胞间隙中积累了大量的Pb，其中细胞间隙中Pb含量最高，细胞壁和液泡次之，细胞质中的最低，具体来讲，细胞间隙、细胞壁和液泡中的Pb含量分别是细胞质中的3.19、2.47和1.70倍（图1，表2）。表2. Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮细胞中的区域化Table 2. Compartmentation of Pb in root epidermal cells of M. sativa seedlings determined with X-ray microanalysis处理紫花苜蓿幼苗根表皮细胞不同部位中的Pb含量（CPS）细胞壁细胞质液泡细胞间隙对照000010mmol/LPb69.9928.3148.2690.33*表中数据由图1.中的能谱计算而得 CPS（count per second）：X-ray计数单位图1. Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮细胞中微区分布的能谱图A 细胞间隙（处理）B液泡（处理）C细胞质（处理）D液泡（对照）2.3紫花苜蓿幼苗根和叶片中Pb的化学形态紫花苜蓿幼苗根和叶片内Pb化学形态的实验结果表明，在Pb污染下，Pb的醋酸（HAc）提取态和盐酸（HCl）提取态是紫花苜蓿幼苗根内Pb的主要化学形态，它们分别占根中总含Pb量的36%和33%左右。其它形态的含量相对较低，它们的大小顺序为：FHAcFHClFEthanol（12.6%） FNaCl（9.9%） FWater（7.7%） FResidue（0.2%）。在叶片中Pb的主要提取形态与根中的相似，HCl提取态和HAc提取态是主要形态，它们大约分别占叶片中总含Pb量的41%和20%（表3）。表3. 紫花苜蓿幼苗根和叶片内Pb化学形态的含量Table 3. The contents of various Pb forms in leaves and roots of M. sativa seedlings（F: form） 器官处理不同Pb 化学形态的含量 (g/g DW)FEthanolFWaterFNaClFHAcFHClFResidue根对照1.841.472.564.892.374.9110mmol/LPb1541.11943.661208.434431.344105.4726.88叶对照1.051.812.211.412.410.9210mmol/LPb60.7240.2144.7588.23182.4626.372.4 BSO对Pb污染下紫花苜蓿幼苗光合作用和生长的影响从图2和表4可以看出，1.0 mmol/L Pb处理后，紫花苜蓿幼苗光合速率和生长下降。BSO对对照紫花苜蓿幼苗的光合作用和生长没有影响，而对Pb污染紫花苜蓿幼苗光合作用和生长的影响较明显（不加BSO幼苗的Pn和干重分别是加BSO幼苗的1.5和1.2倍）。图2. BSO对Pb污染和对照组紫花苜蓿幼苗光合作用的影响Fig2. Effect of BSO on photosynthesis of M. sativa seedlings with and without Pb contamination表4. BSO对Pb污染和对照组紫花苜蓿幼苗生长的影响Table4. Effect of BSO on the growth of M. sativa seedlings with or without Pb contamination 不同处理条件下每株紫花苜蓿的干重（g/plant）0mmol/L Pb0mmol/L Pb+BSO1.0mmol/L Pb1.0mmol/LPb+BSO0.520.530.480.40*处理10d后的数据3讨论本实验结果表示，在Pb污染环境下，进入紫花苜蓿幼苗体内的绝大部分Pb被富集在根部，而迁移至其它部位的较少。这支持Ye的结果10。由于大部分Pb积累在紫花苜蓿根部，从而减轻了地上部分各器官的毒害作用，一定程度上提高了紫花苜蓿对Pb的耐性。紫花苜蓿根部富集Pb的机理可能涉及到植物体能限制Pb从根部运输到植株茎、叶部分；紫花苜蓿根部具有积累Pb的能力；地上部分具有一定拒Pb的能力或地上部分能把吸收到的Pb重新运回根部等。但是至今还没有一个较合理地解释紫花苜蓿吸收或运输Pb的机理。从X-ray微区分析结果可以看出，Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮细胞内的微区分布明显不同。绝大部分Pb都沉积在细胞间隙（质外体）中，这与前人以其它植物为材料的研究结果是一致的10、11、12、13。说明在Pb污染下，植物根部细胞的质外体可视为重要的Pb离子贮存场所。Pb被局限在代谢活性较低的区域（质外体、细胞壁和液泡），从而阻止过多的Pb进入原生质体，这样，细胞质内的一些重要物质和代谢活动在一定程度上可免受Pb毒害，使紫花苜蓿对Pb表现出一定的耐性。化学存在形式分析表明紫花苜蓿幼苗体内Pb的存在，无论在根部或叶片内，都是以HAc和HCl 提取态占绝对优势，也就是说，进入紫花苜蓿体内的Pb多与一些物质结合形成毒性较低的难溶性化合物，而自由态的Pb含量相对较低，以致它的毒害作用也比较小14。所以紫花苜蓿对Pb的耐性在一定程度上是由于Pb在其体内的存在形式造成的。另外，由于富集在紫花苜蓿根部的Pb是以难溶的HAc和HCL提取态占优势，所以它就不容易由根部向地上部分迁移。另外BSO能够加剧Pb污染对紫花苜蓿幼苗Pn和生长的抑制作用，表明紫花苜蓿对Pb的耐受与植物络和素的形成有关。综上所述，紫花苜蓿对Pb的耐受机理在整体水平上表现为把Pb的积累局限于根部，从而避免对地上部分的毒害；在亚细胞水平上，将Pb区域化于细胞间隙、细胞壁及液泡等微区内，从而避免了Pb在胞质中的过度积累和对代谢酶的抑制作用。同时进入紫花苜蓿植株体内的Pb主要以难溶性的化合物形式存在，一方面阻止了Pb向植株地上部分的运输；另一方面造成其在胞间隙和细胞壁的沉积，减少了其进入细胞的机会和降低了Pb本身的毒性。由于紫花苜蓿具有很高的生物量（biomass），而且其对Pb具有较高的富集作用（表1），所以是一种很有开发和利用价值的土壤污染修复植物，值得深入研究。4 参考文献1 骆永明.金属污染土壤的植物修复.土壤，1999，31(5)：2612652 骆永明.污染土-水环境的植物修复：一种绿色净化技术.见：迈向21世纪的土壤科学， 中 土壤学会编，2000，1351383 孙波，骆永明.超积累植物吸收重金属机理的研究进展.土壤，1999，31(3)：1131194 骆永明. 强化植物修复的螯合诱导技术及其环境风险：土壤， 2000，32（2）：57-615 Gardea-Torresdey, J.L., K.J. Tiemann, J.H. Gonzalez, I. Cano-Aguilera, J.A. Henning, and M.S. Townsend. 1995. Poster: Ability of Medicago sativa (alfalfa) to remove nickel ions from aqueous solution. pp. 239-248. In L.E. Erickson, D.L. Tillison, S.C. Grant, and J.P. McDonald (eds.), Proceedings of the 10th Annual Conference on Hazardous Waste Research, May 23-24, 1995, Manhattan, KS.6 Gardea-Torresdey, J.L., K.J. Tiemann, J.H. Gonzalez, J.A. Henning, and M.S. Townsend. 1995. Removal of copper ions from solution by silica-immobilized Medicago sativa (alfalfa). pp. 209-217. In L.E. Erickson, D.L. Tillison, S.C. Grant, and J.P. McDonald (eds.), Proceedings of the 10th Annual Conference on Hazardous Waste Research, May 23-24, 1995, Manhattan, KS.7 Gardea-Torresdey, J.L., K.J. Tiemann, J.H. Gonzalez, I. Cano-Aguilera, J.A. Henning, and M.S. Townsend. 1996. Removal of nickel ions from aqueous solution by biomass and silica-immobilized biomass of Medicago sativa (alfalfa). J. Hazard. Mat. 49:205-216.8 Li Q, Fritz E, Li TQ, Httermann A. X-ray microanalysis of ion contents in roots of Populus maximowiczii grown under potassium and phosphorus deficiency. J. Plant Physiol. 1991, 138:180-1859 杨居荣、贺建新、蒋婉茹.镉污染对植物的生理生化效应。 农业环境保护， 1995，14（5）：19319710 Ye Z.H, Baker A.J.M, Wong M.H, Willis A.J. Zinc, lead and cadmium tolerance, uptake and accumulation by the common reed, Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steudel. Annals of Botany. 1997, 80:36337011 Nishizono H. The role of the root cell wall in the heavy metal tolerance of Athyrium yokoscense. Plant and Soil. 1987,101:152012 Wang J. Computer-simulated evaluation of possible mechanisms for quenching heavy metal ion activity in plant vacuoles. Plant Physiol. 1991, 97:1154116013 Verkleii JAC, Schat H. Mechanisms of metal tolerance in higher plants. In: Show J (ed). Evolutionary Aspects of Heavy Metal Tolerance in Plant. Boba Raton: CRC Press, F1. 1990. 17919314 Ma J.F, Hiradate S, Matsumoto H. High aluminum resistance in buckwheat. Oxalic acid detoxifies aluminum internally. Plant Physiol. 1998,117:753-759Phytoremediation of Pb-contaminated soil with alfalfa: capacity and mechanismsYe Chunhe(Department of Geography, Jinan University 250022, Jinan, Shandong, P. R. China)Abstract After being treated with 10mmol/L Pb(NO3)2 for 10 days, alfalfa (Medicago sativa L.) seedlings were analyzed for Pb contents in the different parts (roots, stems and leaves) of the plant, subcellular compartmentation of Pb in the epidermal cells in roots by X-ray microanalysis and the