谷胱甘肽的医药价值.doc

谷胱甘肽的应用价值王健（衡阳师范学院，衡阳，421008）摘要：谷胱甘肽(GSH)是生物体内最重要的低分子活性巯基化合物之一，同样也是一种重要的医药保健产品，在临床上用于肝脏保护、治愈肿瘤、解除氧中毒抗衰老和治疗内分泌紊乱等疾病，效果明显无毒副作用，在医疗、保健品加工等领域有广泛的市场。本文主要介绍GSH的生产方法及其市场前景。12关键词：谷胱甘肽，合成谷胱甘肽,发酵生产谷胱甘肽，谷胱甘肽的前景The medical value of glutathione(Hengyang Normal University，hengyang,421008)Abstract: Glutathione (GSH) in vivo is the most important low molecular weight active thiol compounds one is also an important medicine and health products, clinically used for liver protection, cure the tumor, the lifting of oxygen poisoning, anti-aging and treatment of endocrine disorders and other diseases, the effect is obvious toxic side effects in the field of health care, health care products and processing a wide range of market views Domestic research and production status of GSH, product use and market prospectsKey Words:GSH,synthesis of GSH,Fermentative production of GSH,the prospect of GSH.谷胱甘肽（glutathione）广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，具有还原型（GSH）和氧化型（GSSG），生物体内大量存在并起主要作用的是GSH。GSH广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病，并作为生物活性添加剂及抗氧化剂用于食品领域。2谷胱甘肽（Glutathione，GSH ），即 -L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由 L- 谷氨酸、L- 半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的生物活性三肽化合物。GSH 是许多酶反应的辅基，在生物体内具有清除体内自由基、解毒等多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境具有重要意义。3GSH分子量为302.7，氮量为13.67，硫量为10.44，旋光度为 21.3（27，2%水溶液），熔点为189193，等电点为5.93，晶体呈无色透明细长拉状.1 GSH 的固体较稳定，而水溶液在外界环境中受温度、pH、光照等条件影响，易氧化，产生氧化型谷胱甘肽（即GSSG），GSSG 是由两分子 GSH 脱氢后通过二硫键相连的二聚体，其反应如下：2GSHGSSG氧化型 GSSG 不具有生理活性，只有还原型GSH才能发挥重要的生理功能。GSH 的不稳定性是造成较难分离纯化、产品纯度不高的重要原因。3GSH的生产方法分类1 化学合成法4随着多肽合成技术的日趋成熟，现已能用化学合成法合成GSH，但由于性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度不高而难以推广。2 从谷物胚芽中提取GSH谷物胚芽特别是小麦胚芽中含有大量GSH。早在1940年代，人们就通过沉淀蛋白质从麦胚粗提GSH；1950年代初，利用有机溶剂从胚芽中抽提GSH。随后又有应用淀粉酶、蛋白酶和高效膜分离技术简化操作工艺，提高收率。一般的工艺流程为：提取盐析离子交换（或膜分离）浓缩结晶。此法GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高，而且消耗大量粮食，现已很少使用。3 微生物发酵生产GSH微生物细胞内含有谷胱甘肽，且发酵周期短、操作简单、成本低。基本工艺为：发酵细胞破碎提取分离GSH。GSH在细胞内特殊的生理功能使其对自身合成产生反馈抑制，用诱变手段减弱或消除这种反馈抑制非常重要。近年颇受重视的是将编码GSH合成酶系的基因克隆到大肠杆菌或酵母中。 3.1 E.coli基因重组 E.coli菌种细胞中GSH含量虽较酵母少，但它的遗传背景清楚、简单，基因操作方便，菌体繁殖较快。为了消除GSH对GSH合成酶（GSH-I）的反馈抑制，Murata5从E.coli中筛选了1株GSH-脱敏的突变株，从中克隆了GSH-基因（gsh）并在E.coli BRC912表达，使此株GSH合成活性大为提高，产量达4.81 mol/g（湿细胞）。GSH-活性提高后，GSH-就成了合成GSH的限速酶。沈立新等6构建了含有GSH和GSH-基因（gsh的重组质粒，分别转入E.coli细胞，分步进行-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的合成，合成率达3.78 g/L，比同时转入的合成率高42.1 %，既解决了GSH-和GSH-在同一菌株中克隆表达相互影响的矛盾，又解决了GSH对GH-的反馈抑制，降低了ADP对第二步反应的抑制程度。3.2 酵母基因重组 酵母糖酵解产生的ATP是GSH合成过程中不可少的能量供体。利用基因工程手段增加酵母中GSH合成酶系活性是提高GSH合成率的另一有效途径。Tazuka等7将E.coli B中gsh基因片段与S.cerevisiae 98的1个启动子融合，融合的GSH-在酵母中表达，结果GSH-活性和GSH的含量分别提高了100多倍和3倍多。Christine8将带有GSHI、GSHII各1个拷贝的质粒PINE III转化入啤酒酵母，GSH产量达到细胞总干重的1.8 ，大大高于对照菌株。此外，通过优化菌株的培养表达条件也可提高GSH产量。有研究通过反馈控制乙醇浓度流加葡萄糖，利用正交试验设计优化发酵后期添加3种氨基酸配比和浓度，进行酿酒酵母T65补料分批发酵生产GSH，产量达到2.19 g/L9-11。卫功元等12-14研究了温度、pH、溶氧和补料流加速度对产朊假丝酵母生产GSH的影响，发现较高温度对细胞生长有促进作用，较低温度则更有利于提高GSH产量，pH 5.5时对细胞生长和GSH合成均最佳，恒溶氧控制发酵可明显提高细胞干重和GSH产量，当恒溶氧浓度35 %时，二者的提高幅度可分别达到22 %和30 %，指数流加是较理想的补料方式。经优化培养，GSH产量达到857.2 mg/L。除E.Coli和酵母外，傅瑞燕等15构建了重组乳酸乳球菌生产GSH，用乳酸链球菌素诱导4 h后，胞内GSH含量达到358 n mol/mg蛋白质。4 酶工程法合成GSH用分离提取的酶或游离细胞进行催化反应，减少了细胞代谢副产物对分离提取的影响，简化了下游工艺。早期研究中用去污剂和溶壁酶处理啤酒酵母增大细胞的通透性，加入含有葡萄糖、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸等前体的反应液，GSH产量大大增高，达9.06 g/L。也有人将经甲苯通透处理后的重组E.coli与干酵母细胞一起加入反应体系，GSH含量达5 mg/mL。由于游离酶难以重复使用，并影响产物的分离提取，故用固定化酶催化合成GSH。将自溶后的啤酒酵母分离出GSH合成酶，用聚丙烯酰胺凝胶包埋后加入反应液，半胱氨酸转化率为87 （游离酶为47 ），且稳定性提高。用固定化细胞法具有特定的优势，这是因为：（1）GSH合成酶是双酶体系，酶的分离提取更加繁琐，用固定化细胞催化合成GSH避免了繁杂的酶分离过程；（2）GSH合成过程需ATP作能量供体，实际生产过程中不可能直接加入ATP，而且ATP利用后生成的ADP对GSH-及GSH-有抑制作用，因此，提供合适的ATP再生体系无论从经济角度还是从酶反应角度均较为合理。ATP再生由酶系完成，固定化细胞可以利用相应菌株细胞内的ATP再生酶系和GSH合成酶系，通过偶联或与其它GSH合成酶活性较高菌株固定化细胞的种间联合成GSH，其优势是固定化酶法合成GSH无法比拟的。谢雷波等16将S.cerevisiae TB6用卡拉胶与魔芋粉混合载体固定合成谷胱甘肽，在pH 7.0，37 ，磷酸盐缓冲液0.1 %的条件下反应6 h，固定化细胞合成GSH产量为550 mg/L。与固定化酵母生产GSH相比，含GSH合成酶系的重组E.coli具有稳定性好、成本低廉等优点，但须解决GSH合成过程中ATP再生的问题。已有许多ATP再生方法和GSH酶反应偶联合成GSH。利用E.coli细胞的乙酸激酶和GSH合成酶系，以乙酰磷酸为磷酸供体将ADP等再生为ATP，合成GSH，偶联效果较好。但乙酰磷酸成本较高且不稳定，难以工业化生产。沈立新等17用卡拉胶固定E.coli生产GSH，优化条件下罐式反应器GSH的产量为 0.84 g/L，稳定性较好；此外，与酵母生产ATP体系相偶联的共固定化体系在填充床中反应，GSH合成量达1.24 g/L，收率比直接加入ATP提高24.2 %。童群义等18将E.coli与啤酒酵母用PVA-卡拉胶混合载体固定生产GSH，比单一固定化E.coli或单一固定化啤酒酵母效果好，但GSH合成无明显提高。主要是由于偶联体系在磷酸盐缓冲液浓度的不协调性引起的，再生ATP的高浓度磷酸盐缓冲液对GSH合成酶系产生抑制作用；而且ADP、ATP在E.coli和酵母两体系间的传递受到限制，也影响了偶联体系GSH合成效率。目前国内外常用的GSH工业生产方法是酵母发酵法，工艺较成熟，但产量有待提高。与ATP再生体系偶联合成GSH，乙酰激酶尽管效率较高，但乙酰磷酸的高价格及稳定性限制了此法的产业化；酵母糖酵解途径成本低廉，虽在胞二磷胆碱和NADP的合成方面获得成功，但合成GSH的效率较低，主要是ATP再生反应效率不高，反应条件与GSH酶系催化合成GSH的条件不协调以及由此造成的成本较高限制了此方法潜力的发挥。表1 22个城市样本医院前1O位肝病辅助治疗药物份额及增长率 类别 2009年2010年 同比增长率 谷胱甘肽17.55%16.87 %11.92多烯磷脂酰胆碱14.04%14.1417.31%复方甘草甜素 10.59%10.66 %17.24 %门冬氨酸鸟氨酸9.37%9.24%14.82 %异甘草酸镁 6.09%7.00%34.17%腺苷蛋氨酸4.62%5.29%33.49%硫普罗宁4.19%3.31%7.87%甘草酸二铵4.00%3.35%2.56%水飞蓟宾2.52%2.233.08%双环醇2.30%2,60%31.51%(注1；按样本医院数据统计；注2：以2010年市场份额为排名顺序)谷胱甘肽市场前景光明 辅助肝病治疗不可或缺 据最新统计数据显示，2010年谷胱甘肽总体市场在国内22城市样本医院肝病辅助治疗药物中居于首位，2009年占比1755 ， 2010年占比1687 。(见表1) 众所周知，我国是世界公认的肝病高发 国家之一，病毒性肝炎、脂肪肝、酒精性肝病、 药物性肝损害及肝癌等严重威胁着人民的健 康。据2007年中国卫生统计年鉴显示，我国病毒性肝炎的发病率增长较快，已由2000 年的649110万人上升至2006年的102.910万人，每年因肝病给社会造成的损失高达1000多亿元。 国产谷胱甘肽占主导地位 至2011年5月，国内已有26张生产批文全部为制剂，包括武汉五景药业的谷胱甘肽滴眼液，重庆东亚药业的谷胱甘肽含片，以及上海复旦复华药业的注射用谷胱甘肽等。 谷胱甘肽进口注册批文共有12张，注射剂包括意大利福斯卡玛的泰特和意大利斯德大药厂的古拉定，滴眼液主要是日本千寿制药的乃奇安和医士药厂的依士安。 目前，国内谷胱甘肽原料药虽然仍在研制开发中，据悉已有突破性进展。谷胱甘肽原料的大规模生产技术开发一直是国家大力扶持的项目。据文献报道，谷胱甘肽的生产工艺 主要是发酵法、酶转化法与化学合成法。如今，化学合成法和提取法已经工业化，酶转化法正在进行广泛开发。而工业化规模生产仍是下一步的关键环节。2010年，国内22个城市样本医院销售的注射用谷胱甘肽用药市场已达331亿元，增长率达1205%。在这一市场中，国产还原型谷胱甘肽粉针剂占据了主导地位，其生产厂商和品牌居第一位的是重庆药友制药的阿拓莫兰，随后是上海复旦复华药业的谷胱甘肽粉针剂，山东绿叶制药的绿汀诺、昆明积大制药的松泰斯，四家占据了83 的市场份额。而进口品牌则分羹另外17 %的市场，主要是意大利斯德大药厂和香港积华药业销售的古拉定，及福斯卡玛药厂的泰特，其中古拉定在谷胱甘肽进口药中占34，而泰特仅占 14。 从2010年样本医院统计数据分析，销售额超过千万元的有12个城市(或地区)。用药量最大的是上海，其次是北京、珠三角(除广州)、广州和杭州，前5个城市(或地区)占这一品种总体市场的半壁江山，达5139 %。用药金额不足千万元的另外10个区域合计占据了1335% 。 用药领域不断拓展 据统计，近年来干眼病患者正以每年10%20% 的速度快速增加，人群发病率最高达到30%。而近视患病人数亦逐年增多，且低龄化趋势日益明显。这两种病为人工泪液、眼药水等药品提供了广阔市场。同时，谷胱甘肽本药的活性成分为还原型谷胱甘肽，它在细胞内参与氧化还原过程，起着SH酶的赋活、辅酶作用，能防止紫外线诱发的自内障，抑制角膜溃疡，并控制进行性自内障的发展及视网膜病变。据某研究机构数据显示，2009年我国眼科用药销售额为6165亿元，比上年同期增长了10% 。销售的药物仍以抗感染、抗干眼病、抗青光眼等为主。另外，谷胱甘肽作为生物活性强化剂，在食物添加剂领域的使用也日益受到人们重视，国外已开发了相关的功能性食品。让GSH广泛应用于食品领域，如加入酸奶和婴儿食品中就能起类似维生素C的稳定作用；防止水果罐头水果褐变；在面制品中起还原和强化氨基酸作用；缩短面包混揉时间4；GSH在与谷氨酸钠、核酸系呈味物质或其混合物共存时具有肉类风味；GSH可抑制肉食类、鱼类和海鲜类食品的核酸分解，延长保鲜期以及提高奶酪质量，防止酪蛋白褐变。2 综上所述，谷胱甘肽是一个颇有市场前景的品种，不但在抗肝炎病毒药、肝病辅助用 药及眼科用药领域发挥了较好作用，而且医学界已开始研究其在心血管及循环系统中的 应用。随着肽类物质研究的不断深入，肽类物质具有的神奇功能不断被发现，谷胱甘肽将成为值得关注的重要品种。 参考文献1国内谷胱甘肽研究进展 张照明，张海涛 ，袁利明 2009年 37卷 第3 期 广州化工2还原型谷胱甘肽的研究进展 胡圣尧 聂志妍 袁勤生 食品与药品 Food and Drug 2009年第11卷第01期 中图分类号：Q516 文献标识码：A 文章编号：1672-979X (2009)01-0069-033 还原型谷胱甘肽的稳定性研究 朱义福 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.8 文章篇号 1673-9078(2011)8-919-9234Cacciatore I, Caccuri A M, Di Stefano A, et al. Synthesis and activity of novel glutathione analogues containing an urethane backbone linkageJ. Farmaco, 2003, 58(9): 787-793.5 Murata K, Kimura A. Overproduction of glutathione and its derivatives by genetically engineered microbial cellsJ. Biotechnol Adv, 1990, 8(1): 59-96.6沈立新，魏东芝，尧辉. 重组大肠杆菌催化合成谷胱甘肽的研究J. 西北大学学报（自然科学版），2003，33（5）：554-557.7Ohtake Y, Watanabe K, Tezuka H, et al. Expression of glu-tathione synthetase gene of Escherichia coli B in Saccharomy-ces cerevisiaeJ. J Ferment Bioeng, 1989, 68: 390-399.8Christine L H. Recombinant yeast for manufacture of glutathioneP. EP 300 168, 1989.9Wen S H, Zhang T, Tan T W. Maximizing production of glutathione by amino acid modulation and high-cell-den-sity fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiaeJ. Pro-cess Biochem, 2006, 41(12): 2424-2428.10Wang Z, Tan T W, Song J. Effect of amino acids addition