细菌纤维素酶结构和功能总结.doc

纤维素酶结构和功能概述了细菌纤维素酶的水解机制及其基因的克隆和表达，总结了近年来纤维素酶结构和功能方面的研究成果，展望细菌纤维素酶领域的研究前景。1 引言2 纤维素分解性细菌的类群 纤维素分解性细菌是指能分解纤维素的细菌分三大类群：（1）厌氧发酵型：芽孢梭菌属（Clostridium）、牛黄瘤胃球菌属（Ruminococcus）、白色瘤胃球菌（Ruminococcusalbus）、产琥珀酸拟杆菌（Bacteroidessuccinogenes）、产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobactersuccinogenes）、溶纤维菌（Butyrivibriofibrisolvens）、热纤梭菌（Clostridiumthermocellum）、解纤维梭菌（Clostridiumcellulolyticum）；（2）好氧型：粪碱纤维单胞菌（Cellulomonasfimi）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、纤维弧菌属（Cellvibrio）、发酵单胞菌（Zymomonas）、混合纤维弧菌（Cellvibrimixtus）；（3）好氧滑动菌，如噬胞菌属（Cytophaga）。 4细菌纤维素酶分类 细菌纤维素酶是多酶复合体系，根据各酶的功能可分为三大类：（1）内切葡聚糖酶（1,4-D-glueanohydrolase或endo-1,4-D-glucanase，EC3.2.1.4），简称Cen。作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素，其分子量大小约为23-146KD。（2）外切葡聚糖纤维二糖水解酶（1,4-D-glucancellobio-hydrolase或exo-1,4-D-glucanase,EC3.2.1.91），简称Cex。作用于纤维素线状分子末端，水解-1，4-D-14糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase），分子量约38-118KD。（3）-葡萄糖苷酶（-1,4-glucosidase,EC3.2.1.21）简称BG或称纤维二糖酶。这类酶一般将纤维二糖或可溶性的纤维糊精水解成葡萄糖分子，其分子量约为76KD。 5细菌纤维素酶水解机制 好氧细菌的三种纤维素酶是以各自独立的形式分泌到细胞外水解纤维素的；厌氧细菌的三种纤维素酶以多酶复合体形式结合在细胞壁上对纤维素进行水解。细菌纤维素酶通过多酶复合体系各组分协同作用彻底有效降解天然纤维素。Cen负责进攻纤维素的非结晶区，随机水解-1，4-糖苷键，将长键纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素Cex负责从纤维素线状分子的非还原性末端水解切下纤维二糖单位BG则将纤维二糖水解成葡萄糖在已知结构的细菌纤维素酶分子中，通过在异头碳原子位通过构型的保留或构型的转化完成催化反应，其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂，如C.thernmocellum的内切酶CelC催化域中Glu-280和Glu-140分别作亲核试剂和质子供体,C.fimi的外切酶Cex的Glu-574和Glu-645分别作亲核试剂和质子供体，证明了细菌纤维素酶降解纤维素的水解双置换机制。由于纤维素底物的高度复杂性以及底物的多样性，纤维素水解过程的并没有完全清楚。因此，纤维素酶系的降解机理还有待进一步研究和探讨。 6细菌纤维素酶的结构和功能 通过对粪碱纤维单胞菌（Cellulomonasfimi）的一个外切酶Cex和一个内切酶CenA的研究表明，细菌纤维素酶的纤维素结合结构域（CBD）位于氨基端或羧基端，它借助连接桥（Linker）与催化结构域（CD）连接。在多种细菌的纤维素酶中发现有相似的结构。 催化结构域（CD） 纤维素酶分子的催化结构域主要体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。不同 来源纤维素酶分子量差别很大，但其催化区的大小却基本一致，活性位点的三级结构都是保守区域。JuyMet等采用x光衍射的方法对热纤梭菌的CelD的催化域进行了结晶和解析。结果表明，内切酶的活性位点位于一个开放的“裂缝”（Cleft）中，可与纤维素链的任何部位结合并切断纤维素链；外切酶的活性位点位于一个长“环”（1oop）所形成的“内部通道”（tunnel）里，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。细菌的外切酶有两个酶切位点，有限酶切时，可将CBD和连接桥分别切去。MeinkeA等利用蛋白质工程的方法将粪碱纤维单胞菌的外切酶CbhA分子的Loop删除后，发现该酶的内切酶活性提高。根据其氨基酸序列的相似性已知的纤维素酶的CD可分为70多个家族，在同一家族内具有相似的分子折叠模式和保守的活性位点，因此在同一家族内，其反应机制和对底物的特异性都可能相同，这已通过实验得到证实。纤维素结合结构域（CBD） 许多纤维素酶主要依靠在肽链N端或C端的CBD结合底物，该结构又称纤维素结合模块，其功能是将相邻的催化结构域传递到晶体纤维素底物上。细菌纤维素酶的CBD由100-110个氨基酸组成，同源性较低。细菌CBD平坦的表面只露出2个或3个芳香族氨基酸残基和一些形成氢键的残基,多项研究证实，这些残基与CBD对结晶纤维素的结合有关。一些细菌的CBD结构有一定的共同特点：带电荷氨基酸含量很低；羟基氨基酸含量很高；都含有Trp、Asn和Gly，而且两个Cys在N、C末端的位置完全相同。汪天虹等用多维核磁共振和X射线衍射技术，证实了族C.FimiCex、Cen以及族CthermocelhunCip的CBD有相似的结构：由2个片层面对面折叠在一起，形成一个三明治结构，CBDcex含有一个单一的二硫桥连接N-末端和C-末端，CBDcip有一个Ca2+的高亲和性结合位点6。然而，有的CBD的作用似乎不在于跟底物结合，而是破坏晶体纤维素链间的非共价相互作用；或者不仅结合底物，还提供结合不同底物结构的优先权。杨永彬等通过实验证实家族的CBD能够促使纤维素中氢键的断裂,从而释放单根纤维素分子链7。C.fimi的CenA或Cex单独的CBD不具备对纤维素的水解活力，但能破坏棉纤维，形成短纤维，具有疏解结晶纤维素的能力。实验证明，细菌纤维素酶中的CBD对酶的催化活力是非必需的，但它们具有调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用。 连接桥（1inker） 连接肽（1inker）一级结构的研究发现，细菌纤维素酶分子的连接肽富含脯氨酸（Pro）和丝氨酸（Thr），完全由Pro-Thr这样的重复序列约100多个氨基酸残基组成。在高级结构的分子形状上，细菌连接肽、CD、CBD之间呈135o。连接肽的作用可能是保持CD和CBD之间的距离，有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体。 纤维素酶降解纤维素是酶的各组分之间协同作用的结果，目前主要有2种观点：一种观点认为，首先由EG在纤维素分子内部的无定形区进行酶切产生新的末端，然后由CBH以纤维二糖为单位由末端进行水解，每次切下1个纤维二糖分子，最后由BG将纤维二糖以及短链的纤维寡糖水解为葡萄糖。另一种观点则认为，首先是由CBH水解不溶性纤维素生成可溶性的纤维糊精和纤维二糖，然后由EG作用于纤维糊精生成纤维二糖，再由BG将纤维二糖分解成2个葡萄糖。这种协同作用方式也决定了纤维素酶表达调控的复杂性。7细菌纤维素酶基因的克隆与表达 细菌中编码纤维素酶的基因在基因组的分布为随机的或形成基因簇。在基因簇中，有转录终止子，没发现有启动子。人们已从40多种细菌中克隆到了纤维素酶基因，其中一些酶基因已经在大肠杆菌和酵母中得到表达。如从Stropyomyces、Clostridium、Thermoanaerobacter、Themomonspora、Erwinia、Pseudomonas、Cellvibrio、Ruminococcus、Cellulomonas、Fibrobacter和Bacillus中成功分离出葡聚糖基因，并先后克隆了瘤胃的Bacteroides、succinogenes、ButyrivibriospRuminococcusalbus等细菌的纤维素酶基因，同时热梭菌中的11种内切纤维素酶（CelA、CelB、CelD、CelE、CelF、CelG、CelH、CelI、CelJ、CelK、CelS）的基因已经被克隆，嗜纤维梭菌的5种内切纤维素酶（EngA、EngB、EngC、EngD、EngE）已经测序并在大肠杆菌中得到表达。不同的细菌中克隆了内切葡聚糖酶基因。Kim等克隆了AquifexaeolicusVF5编码EG的ce18Y基因，在E.coliXL1-Blue中成功表达，Hakamada等运用盒式连接介导PCR和反向PCR克隆到了基因egl-257。人们将纤维素酶、纤维二糖等外源基因转入运动发酵单胞菌（Zymomonasmobilis）中并得到不同程度的表达，有望将它改造为能将纤维素转化为乙醇的重组菌株并在工业中广泛应用。细菌葡聚糖酶基因在S.cerevisiae的启动子和信号肽的控制下构建在同一质粒载体上，然后转入S.cerevisiae，重组菌可向培养基分泌保留70%活性的葡聚糖内切酶和外切酶，这种酶能够分解滤纸和木浆中的纤维素。 7展望 细菌以多酶复合体结构彻底有效降解天然纤维素，纤维小体是研究较多的细菌纤维素酶复合体。纤维小体的作用方式是理解纤维素降解和利用纤维素资源的关键。进一步了解纤维小体结构的普遍性，不同来源的纤维小体的组成同源性和多样性，纤维小体蛋白质之间的相互作用，纤维小体组织结构的形态发生等，从而为工程改造纤维小体，利用纤维素资源提供基础。 提高纤维素