引用标准 EP2.6.12和2.6.13.doc

目的：建立微生物限度检查法标准操作程序。2 范围：用于原辅料、包装材料、中间产品以及成品的微生物限度检验。3 责任:质量部。4 内容4.1 引用标准: EP2.6.12和2.6.134.2 方法提要: 通过对试样在不同条件下的微生物培养，检查试样受到微生物污染程度情况。微生物限度检查法系检查非灭菌原料药及其原、辅料受到微生物污染程度的方法，检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌的检查。微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为3035，霉菌、酵母菌培养温度为2025。检验结果的报告以1g、1mL、10 mL或10cm2为单位报告。4.3样品的制备 取样方法: 产品取样必须依照规定的采样方法取样。在每批样品中取三个样品并分别检查。4.3.1水溶性产品：在pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中稀释10g 或10ml产品。一般准备1：10稀释倍数，作为供试液。不过，根椐产品的特性或必要的敏感性也可做成其它的比例的。如果已知此产品有抗微生物活性，可加入灭活剂到稀释液中。如果需要调节pH值，调至pH值约为7，如果需要进一步稀释，用相同稀释液进行系列10倍稀释。4.4阴性对照为了确定实验条件对检测结果无影响，要用稀释剂代替供试液进行阴性对照试验。应无菌生长。对于不合格的阴性对照结果应进行调查。4.5培养基促生长试验（阳性对照）适用于每一批购买的现成培养基，每一批使用脱水培养基制备的培养基或者按照指定成分配制的培养基。按照表1所示，接种少量的菌种（不多于100 CFU）于大豆酪蛋白胰酶消化物肉汤和大豆酪蛋白胰酶消化物琼脂培养基中，每一份菌种接种于各自的培养基上。按照表1所示，接种少量的菌种（不多于100 CFU）于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，每一份菌种接种于各自的培养基上。在表1所示的条件下培养。对于固体培养基，得到的菌落数与标准接种体的数量相差应不超过2倍。对于新鲜制备的接种体，微生物的生长状况应该和以前的一批培养基（经过检测和验证的）所得到的微生物生长情况相当。如果和以前的一批培养基（经过检测和验证的）所得到的微生物生长情况相比有明显的变化，可以改用液体培养基。表 1 试验菌的制备和使用4.4产品的检测4.4.1薄膜过滤法: 薄膜过滤用的薄膜孔径不超过0.45um,其截取细菌的有效性经过确认。在选择滤膜材质时，应确保供试品不影响细菌过滤或截留的的有效性。一种微生物使用一个薄膜过滤器。吸取按照规定方法制备的样品溶液适量，（一般都取相当于1g的样品溶液，如果预知细菌数量较多的情况下也可以吸取更少量的溶液）每个样品迅速过滤制备二个滤膜片，每个滤膜器都用大约100ml的适当液体，如pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液清洗三次。在溶液中，可以加入表面活性剂聚山梨酯80或抗微生物的灭活剂。如果通过验证，清洗次数也允许少于3次。对于总需氧菌的检测，将一个薄膜置于大豆酪蛋白胰消化物琼脂培养基上进行培养，培养温度为3035,培养时间为35天。对于霉菌和酵母菌总数的检测，将另一薄膜置于沙氏葡萄糖琼脂培养基上进行培养，培养温度为2025，培养时间为57天。选择那些菌落数小于100的平板进行计数，并计算每克或每毫升的菌落数（CFU/g,或CFU/ml）。4.5平皿法（倾注法）4.5.1：取供试液1mL,置于9cm培养皿中,每一个稀释水平的每一种培养基制备至少两份平板，加入15ml20ml适合培养细菌的大豆酷蛋白胰酶消化物琼脂培养基，培养温度为3035,培养时间为35天。加入15ml20ml ml适合培养真菌的沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度为2025，培养时间为57天。琼脂熔化温度不超过45选择一个溶液平板计数，平板计数选择小于250的总需氧菌菌落数的稀释级平板，选择小于50的霉菌和酵母菌菌落数的稀释级平板，计算出每克或每毫升产品的平均菌落数（CFU/g,或CFU/ml）。4.6培养基的有效性和计数法的正确性让试验细菌株分别在含有适宜液态培养基（例如 肉汤介质A）中生长，温度在3035 ，生长时间为48小时。让试验真菌株分别在含有适宜液化培养基（例如无抗生素的介质C）中生长，白色念珠菌在2025生长48小时，黑曲霉菌要在2025生长7天 。金黄色葡萄球菌 例如ATCC 6538 (NCIMB 9518,CIP 4.83)大肠杆菌 例如ATCC 8739 (NCIMB 8545,CIP 53.126)枯草芽孢杆菌 例如ATCC 6633 (NCIMB 8054,CIP 52.62)白色念珠菌 例如ATCC 10231 (NCPF 3179,CIP 48.72)黑曲霉菌 例如ATCC 16404 (IMI 149007,CIP 1431.83)用pH=7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液制备，每毫升含有约100个菌落（CFU）菌悬液。在有无待测产品的情况下，都要用每个微生物的菌悬液作为一种验证计数方法。当用膜过滤法或平板计数法测试时,任何微生物从接种得到的验证试验不得超过五代,。4.7结果的解释 细菌的计数以在大豆酷蛋白胰酶消化物琼脂培养基上显示的平均菌落数(CFU)为准,如果在大豆酷蛋白胰酶消化物琼脂培养基发现了真菌，也按总需氧菌计数。真菌的计数以在沙氏葡萄糖琼脂培养基上显示的菌落数(CFU)为准,如果在沙氏葡萄糖琼脂培养基上发现了细菌，也按真菌计数。4.8大肠埃希氏菌将待测样品按前述4.3的方法进行处理，将10ml或相当于1ml（1g）样品量接种至100mL肉汤培养基A中，混合均匀后在3537下培养1848h。振荡容器，将样品混合均匀，将1mL样品移液至100mL肉汤培养基G中，在43 45下培养18-24h。在琼脂H平皿中在3537的情况下按1872小时进行传代培养。长出的红色的、非黏性的革兰氏阴性杆菌表明存在大肠杆菌。还可以用合适的生化试测进行确认，例如生成吲哚(通过滴加几滴靛基质试液,液面呈红色, (靛基质阳性)进行确认)。如果不可见此类菌落或证实性实验呈阴性，则产品该测试项合格。4.9 溶液和培养基配制下列的溶液及培养基可满足测试中按照药典对微生物污染方面的要求。4.9.1 pH=7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液:磷酸二氢钾 3.6g,磷酸氢二钠 7.2g,氯化钠 4.3g,蛋白胨（肉或酪蛋白）1.0g,纯化水 1000ml用验证过的方法灭菌。4.9.2大豆酪蛋白胰酶消化物肉汤）大豆酪蛋白胰酶消化物 17.0g大豆粉木瓜酶消化物 3.0g氯化钠 5.0g,磷酸二氢钾 2.5g,单水合葡萄糖 2.5g,纯化水 1000mL，调节pH值在灭菌后25时pH为7.30.2，用验证过的方法灭菌。4.9.3大豆酪蛋白胰酶消化琼脂 大豆酪蛋白胰酶消化物 15.0g,大豆粉木瓜酶消化物 5.0g,氯化钠 5.0g,琼脂 15.0g,纯