氨基酸纸上层析.doc

氨基酸纸上层析【实验目的】学习并掌握氨基酸纸上层析的原理和方法。【基本原理】用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法，是一种分配层析。纸层析所用的展层溶剂大多有水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱。因此。在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。当溶剂由下向上移动，称上行法；由下向上移动，称下行法。将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距离不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用Rf值（比移值）表示：Rf = 原点到层析点中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数，Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。因此可根据Rf值作为定性的依据。本实验利用纸层析法分离氨基酸。氨基酸为无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色做定性定量分析。 脯氨酸颜色比较特别，为黄色，其他呈紫红色。此实验综合了氨基酸的分类、性质和结构等知识，运用了生化实验中重要操作技术纸层析技术对氨基酸进行分离鉴定。【实验试剂和器材】（一）试剂（1）0.01mol/L的盐酸溶液（2）氨基酸标准溶液：取苯丙氨酸，丙氨酸，赖氨酸，谷氨酸，酪氨酸，脯氨酸，用0.01mol/L的盐酸溶液分别按1mg/mL的浓度配制。（3）氨基酸混合液：以上各种氨基酸按0.5mg/mL的浓度配制成混合液。（4）展层剂：V（正丁醇）：V（80%甲酸）：V（水）= 15：3：2（5）显色剂0.1%的茚三酮溶液：取水合茚三酮0.1g，溶于100mL正丁醇溶液中。（二）器材层析滤纸，尺子，铅笔，120cm的培养皿，1000mL的烧杯，移液枪（2.5L，10L），电吹风，订书机，一次性手套。【操作步骤】（1）滤纸准备取层析滤纸（长约18cm、宽16cm）一张。在纸的一端距边缘23cm处用铅笔划一条基线，在此直线上每隔2cm做一记号，一共做七个，作为点样原点。（2）点样氨基酸点样量以每种氨基酸含520g为宜，用微量移液枪将六种氨基酸样品取5L点于原点（分批点完），分别点在前5个位置上，然后在分别取各样品1L先后点于第七个原点上。注意，每次点完需等到原有的液体干燥后才能点第二次，以避免扩散。理想状态最好使得点子的直径不能超过0.5cm，边点样边用电吹风冷风吹干。（3）展层将点好样的滤纸卷成圆筒，用订书钉订好，纸的两边不能接触。原点在下端，浸立在事先装有展层剂的培养皿中，点样原点不能浸入展层剂中，迅速置于密闭的层析缸中，进行展层。待溶剂展层至距纸上沿12cm时，取出滤纸，热风吹干或者自然干燥，用铅笔描出溶剂前沿界限。（4）显色用喷壶均匀喷上0.1%茚三酮显色贮备液，然后用吹风机热风吹干即可显出各层析斑点。观察各氨基酸分离情况。（5）计算用铅笔圈画出层析斑点，画出斑点中心，测量、算出各种氨基酸的Rf值。【结果分析及讨论】结合各种氨基酸的结构特点，分析及讨论实验结果。【注意事项】1.点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨基酸斑点不必要的重叠。吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。2.实验过程中，尽量不要用手去触碰层析滤纸，戴手套操作。3.在订滤纸筒时要避免滤纸的两端完全接触。【思考题】1.分