总酵母生产实训3.doc

广东轻工职业技术学院 生物制药综合实验生物制药综合实验 指指 导导 书书 编者 生物制药教研室编者 生物制药教研室 生物制药教研室生物制药教研室 2008 年 2 月 1 目目 录录 第一章 绪论第一章 绪论 2 一 实验目的 2 二 实验内容和进度安排 2 三 训练技能与要求 3 第二章 酵母菌种选育及纯培养第二章 酵母菌种选育及纯培养 4 一 酵母菌种培养基的制备 4 二 酵母种的纯化分离与扩大培养 5 第三章 原料处理第三章 原料处理 8 一 糖蜜处理的目的 8 二 糖蜜处理的原理 8 三 糖蜜处理的方法 9 第四章 酵母生产工艺流程第四章 酵母生产工艺流程 10 一 酵母发酵工艺原理 10 二 酵母生产工艺流程 11 三 发酵工艺条件 12 四 发酵工艺操作 12 五 酵母的产品质量控制 12 第五章 酵母片压片工艺流第五章 酵母片压片工艺流 程程 14 一 干酵母片的处 方 14 二 制 法 14 三 单冲压片机的安装与调 试 14 四 片剂质量检 查 15 参考书目参考书目 16 附录附录 1 糖蜜处理后质量分析 糖蜜处理后质量分析 17 附录附录 2 发酵罐操作使用规程 发酵罐操作使用规程 18 附录附录 3 酵母生产中的检测分析 酵母生产中的检测分析 22 2 第一章 绪第一章 绪 论论 一 实验目的一 实验目的 本实训项目 利用糖蜜高密度生产酵母片 是目前生物技术中应用和 研究较为活跃的领域 酵母中富含维生素 B1 维生素 B2 烟酸 还含有维生 素 B12 维生素 B6 叶酸 肌醇 转化酶等 一般来说 人体内不能合成维生 素 B1和维生素 B2 需通过摄食补给 人体一天最多吸收 12 毫克左右的维生素 B1 若缺乏维生素 B1可以引起脚气病 心功能不全 多发性神经周围炎 体 重下降及厌食 维生素 B2每日需要量约 2 毫克 缺乏会引起口角炎等皮肤病 变 烟酸在体内转变成烟酰胺后才具有维生素的作用 其功能是降血脂及扩张 周围血管 缺乏烟酸可引起糙皮病 维生素 B12 维生素 B6 叶酸 肌醇能参 与体内氨基酸和脂肪的代谢 所以酵母片在临床上主要用于 B 族维生素缺乏症 及对消化不良有辅助治疗作用 本次大型实验是在学生学习了微生物学 生物化学 生物制药设备及生物 制药工艺学 制剂学等专业课程之后进行的一次综合性实验 是对学生专业知 识掌握程度及动手操作能力的全面强化和考核 在为期二周的实验过程中 希 望学生能以积极认真的态度投入 确保实验顺利完成 在实验中有出色的表现 取得优良的实验结果 二 实验内容和进度安排二 实验内容和进度安排 本实验可分为以下几个部分 1 酵母种的选育 纯化和保藏 2 酵母种的扩培工作 3 糖蜜原料的预处理与培养基的制备 4 发酵罐及其附属设备和管路等结构的了解和操作应用 5 按照发酵工艺的要求 正确操作控制发酵罐进行产品生产 3 6 酵母的离心收集 干燥和制片 相应地实验进度安排如下 第一阶段 即准备阶段 包括实操动员 任务下达 学生分组 查阅资料 设 计拟订整个酵母片生产的工艺方案 了解发酵设备的构成 并用水来模拟发酵 的启动和生产过程中的控制 采样等操作 配置必要的显微染色剂和化学分析 试剂 第二阶段 酵母种的选育 纯化和保藏 第三阶段 糖蜜原料预处理 第四阶段 种子的扩培 第五阶段 上罐生产 第六阶段 酵母产品的分离 制片和干燥 第七阶段 实验用品的整理清洗 第八阶段 整理实验报告 并及时上交 三 三 训练技能与要求训练技能与要求 1 独立制定工艺流程的能力 2 独立制定工作进度的能力 3 确定各种培养基配方和计划培养基用量的能力 4 确定有关检测方法和计划试剂用量的能力 5 掌握菌种分离纯化 保藏的原理和技术 6 掌握种子扩培的原理和技能 7 糖蜜预处理方法和质量鉴定 8 熟练掌握发酵罐管道灭菌 空罐灭菌 实罐灭菌 接种 取样等无菌操作技 能 9 掌握有关工艺参数的控制技能 10 掌握酵母分离 制片和干燥的技能 11 掌握有关检验分析的技能 12 具备初步生产成本分析的能力 13 具备生产指标分析的能力 总结 提出改进 第二章 酵母菌种选育及纯培养第二章 酵母菌种选育及纯培养 4 一 一 酵母菌种培养基的制备酵母菌种培养基的制备 酵母培养一直是人们不懈探索的内容 经过许多年的积累 形成了一些 比较经典的酵母培养基配方 可供参考借鉴 下面就是在工业生产与实验室中 常用的酵母培养基配方 仅供参考 培养基 1 葡萄糖 50 克 磷酸二氢钾 2 5 克 尿素 1 克 酵母膏 0 5 克 硫酸镁 1 克 硫酸铁 0 1 克 孟加拉红 1 0 23 毫升 水 1000 毫升 培养基 2 马铃薯 去皮 200 克 水 1000 毫升 将马铃薯洗净去皮 称取 200 克 切成小块 加 1000 毫升煮沸 1 小时 用双层纱布滤成清液 加水补充因蒸发而减少的水分 培养基 3 蔗糖 150 克 蛋白胨 5 克 磷酸二氢钾 5 克 硫酸镁 2 克 碳酸钙 5 克 水 1000 毫升 培养基 4 蛋白胨 3 酵母膏 0 5 酪蛋白水解物 0 5 葡萄糖 4 硫酸锌 1 4 自然 PH 值 培养基 5 豆汁 100 毫升 酵母膏 2 克 葡萄糖 3 克 自然 PH 值 豆汁制备 取黄豆 100 克 加水 1000 毫升 煮沸 30 40 分钟取汁备用 培养基 6 将普通麦芽汁稀释到 100Bx 调 pH 约 6 4 即成 不同的酵母培养基 具有不同的制备方法 下面仅以麦芽汁培养基的制 备为例 说明酵母培养基制备的基本要求 原理及常用方法 如果需要用到其 它培养基 请自行查阅有关资料 麦芽汁培养基的制备 5 1 原理 利用麦芽中的糖化酶与蛋白酶将麦芽中的淀粉和蛋白质等高分子不 溶性物质逐渐分解成糊精 麦芽糖 多肽和各种氨基酸等可溶解性低分子 物质 加水调节到一定浓度以利于酵母的培养 2 实验材料 大麦芽 无霉变 虫蛀 水浴锅 烧杯 比色板 碘液 玻璃棒 纱布 漏斗 电炉 高压灭菌锅 组织捣碎机 3 实验步骤 首先计算麦芽的用量 根据所要制备的平板 斜面数目 一支平板需培养 基约 15ml 一去斜面约需 5ml 及液体培养基体积计算 一般根据经验 500g 麦芽可配制合格的培养基体积为 1 1 2L 称取大麦芽 用组织捣碎机粉碎 粉碎度适中 不能太粗 也不能太细 分别装入两个 1 升的烧杯中 每个约 250 克 向每个烧杯中加入 4 倍麦芽重量的 60 热水 置于 55 水浴锅中保温糖 化 间歇搅拌 约 30 40 分钟后将水浴锅升温至 65 3 4 小时后 用 玻棒沾取少量糖化液于白色比色板内 加一滴碘液混合 颜色呈棕黄色即糖 化完毕 用纱布过滤出去麦渣 把麦汁煮沸 40 分钟 出现沉淀物质 用多层纱布仔细 缓慢过滤 即得 澄清的麦芽汁 上述麦芽汁约为 15 18 oBx 还应加水调整浓度为 10 12 oBx 原麦芽汁体积 x 浓度 加水量 原麦芽汁体积 要求配制的浓度 灭菌 把制得麦芽汁置于三角瓶中 加棉塞 在高压灭菌锅中灭菌 0 07 MPa 15 分钟 制备琼脂斜面和平板 在上述制得的 10 12 oBx 麦芽汁中 加入 2 w w 的琼脂 加热溶解 调 pH6 4 装入带棉塞的大三角瓶中 在高压 灭菌锅中灭菌 0 07 MPa 15 分钟 然后冷却至 50 度左右 倒入事先已包 扎灭菌好的试管和平皿中 二 二 酵母种的纯化分离与扩大培养酵母种的纯化分离与扩大培养 1 酵母种子的要求 a 酵母种子要纯 菌体粗壮 不能携带有任何其它杂菌 6 b 用于生产的酵母种子要求生长能力强 生长周期短 c 接种的酵母种子要有相当的菌体浓度 一般 109 ml 且总体积能满足生产 规模的需求 2 原理 在进行酵母发酵之前 首先要获得优良纯种酵母 所以要对酵母种 子进行纯种的分离纯化 酵母的发酵生产是在发酵罐中进行 它需要一定 数量的菌种进行繁殖 因此必须把斜面菌种经过多次逐级扩大培养 方可 获得一定数量的菌种 本实验发酵罐为 10 升 实际装量为 6 升 按照接 种量 10 计算 需要 600 毫升左右的酵母种子液 3 实验材料 菌种 各组给定 培养基 麦芽汁琼脂平板 麦芽汁琼脂斜面 无菌水 12 oBx 的麦芽汁 已处理的糖蜜 三角瓶 烧杯 糖度计 灭菌锅 培养箱 4 纯化分离步骤 工艺流程 注 制备菌悬液之前 先要对菌种进行活化 若所用的菌种为斜面菌种 则接 种新斜面培养 24 小时即可 若所用菌种为干菌种 则用无菌水溶解于 38 活 化 1 2 小时 1 20 溶解 每 20min 摇一次 即可 活化结果检查可用美蓝 染色法 取活化液 0 5mL 加入 9 5mL 无菌水 在 50mL 烧杯中 磁力搅拌 5 分钟 打碎酵母 美蓝染色 3min 血球板计数 染色的为死亡 各阶段要求 a 菌悬液制备 称取 1g 菌种 用 100mL 无菌水 将菌种所含酵母细胞悬 浮于其中 制成菌悬液 b 菌种梯度稀释 将上述菌悬液依次稀释为 10 10 10 10 浓 度梯度 c 平皿涂布 将上述各浓度梯度分别涂布麦芽汁琼脂平板 每浓度分别涂 3 个 将涂布好的平皿在培养箱中于 28 30 培养 16 20 菌悬液制备 菌种梯度稀释 菌种稀释液涂布麦芽汁琼脂平皿 培养箱培养 28 30 培养箱培养 28 30 16 20 hr 斜面菌种 挑单菌落观察 鉴定和接种 16 20 hr 麦芽汁琼脂斜面 7 hr d 挑单菌落 从培养好的平皿上 挑选生长旺盛 菌落边缘齐整且比较大的 酵母单菌落 用显微镜观察形态 并接种斜面 培养斜面菌种保藏 5 扩培步骤 工艺流程 注 要求学生自己按照时间 自己设计合理的实验进度 在安排进度时 要注 意避开晚上上夜班的局面 各培养阶段要求 16 24 hr 12 hr 静置 斜面菌种 试管培养 内有 10 毫升液体 250 毫升三角瓶装 100 毫升麦芽 汁 28 30 28 30 摇床培养 28 30 摇床培养 28 30 6 8 hr 发酵罐 700 毫升的种子液 2000 毫升三角瓶装 300 毫升麦芽汁 6 8 hr 和 300 毫升的糖蜜 8 a 斜面菌种的制备 首先用 12 oBx 麦芽汁加入 2 琼脂 制成试管斜面 培养基 灭菌后备用 将酵母种一环 转接到上述培养基中 在 28 30 下培养 镜检达到对数生长旺盛期后即可用于下一阶段 或 放入 4 冰箱保存 b 液体试管培养 从斜面种中挑取一环转接到装有 10 毫升麦芽汁的试 管中 放在培养箱中 28 30 静置培养 10 12 hr 具体培养时间根 据镜检的酵母状况而定 酵母处于对数生长期 大小均匀 数量较多 250 毫升三角瓶中的培养 把 10 毫升培养好的酵母液倒入装有 100 毫升 麦芽汁的 250 毫升三角瓶中 进行摇床培养 150 rpm 28 30 6 8 hr c 2000 毫升三角瓶 中 的扩培 当上述 100 毫升菌液培养成熟后 将其倒 入装 300 毫升麦芽汁 和 300 毫升糖蜜 已加入营养盐 的 2000 毫升三角瓶 进行摇床培养 150 rpm 成熟后接入发酵罐作为种子液 注意事项 a 在菌种扩培过程中 必须严格采用无菌操作方法 手 接种针及三角 瓶瓶口均需用 75 酒精擦拭 b 菌种在扩培过程中必须镜检跟踪酵母的生长状况 菌体形态正常 圆形或椭圆形 没有杂菌 菌体内较少空泡 出芽率 20 30 美蓝 染色 酵母菌的死亡率在 10 以下 酵母培养液应具有酵母香味或少 许酒味 不能有其他杂味 第三章 原料处理 一 糖蜜处理的目的一 糖蜜处理的目的 糖蜜中含有妨害酵母生长繁殖 影响酵母成品质量的杂质必须先经过处 理成棕红色清晰透明 中间无悬浮小粒的液体 才能作发酵的原料 其杂质主 要有以下几种 亚硫酸 其在糖蜜中所存在之浓度 不能超过 二氧化硫 挥发性有机酸 主要为甲酸 醋酸 丁酸 丙酸等 不能超过 0 3 胶体物质和色素 如所含胶体少于 0 008 对于酵母生产亦有影响 而且 会影响酵母色泽 微生物 在糖蜜储藏期中微生物繁殖很快 在发酵进行中影响酵母繁殖 其他因素 如硝酸盐 亚硝酸盐也是有害因素 二 糖蜜处理的原理 二 糖蜜处理的原理 9 加水稀释的作用 糖蜜进厂一般含糖 40 50 浓度太高 不易澄清 因此需稀释到适当浓度 15 17 oBx 进行处理 加酸的作用 由于酸中带阳离子和带阴电荷的糖蜜胶体相互作用 胶体 凝结形成絮片状物 在澄清桶中沉淀 加酸能使部分双糖转化成单糖 加入的 硫酸 磷酸和石灰乳作用产生硫酸钙沉淀 而且加硫酸后可释出挥发酸 可在 沸腾和通风时驱除掉 加热同样能使胶体蛋白凝固 便于沉淀 同时加热主要起灭菌作用 通风的作用 通入空气可使有害气体氧化驱除 如一氧化氮 二氧化硫 硫化氢等 同时通风可驱除挥发酸 如不通风或通风不足 杂质不能在糖液处 理时氧化沉淀 而带到发酵罐中 在发酵通风氧化时 产生的沉淀留在发酵罐 中 这种沉渣和酵母的密度相似 因此在离心机分离时沉渣和酵母不能分离 而使酵母带上深灰色 糖蜜处理的质量与成本要求 质量分析方法及成本核算方式见附录 1 钙的含量 0 02 胶体含量 0 1 处理后成本增加 25 发酵糖转化率 85 发酵糖转化率计算公式为 处理前后样品中糖的测定参见附录 3 处理后还原糖总量 处理前还原糖总量 糖蜜中发酵糖的转化率 处理前总糖量 处理前还原糖总量 灰份含量 测定方法参见附录 4 三 糖蜜处理的方法糖蜜处理的方法 糖蜜处理方法有许多种 要求学生自行查阅资料 了解相应的处理 方法的原理及适用条件 并从中选取一种合适的处理方法对糖蜜进行处理 以 下方法仅供参考 1 糖蜜处理量的计算 根据发酵工艺要求的最后发酵体积及发酵液的菌体浓度要求 结合菌体 对糖蜜的得率常数 计算所需的总糖量 再乘以放大系数 1 2 作为最后需要 糖蜜总量 2 一次处理法 10 1 糖蜜加水稀释至 15 17 oBx 2 加 0 5 按糖蜜重量计 工业用浓硫酸和 0 5 磷酸 磷酸按 45 计 调 pH 在 2 0 至 3 0 之间 3 加热煮沸 4 通风 0 5 1 小时 使温度降到 90 左右 5 加石灰乳使 pH 至 4 8 5 1 澄清 16 24 小时 若沉淀不完全 可 用离心去除 3 二次处理法 适于含杂质较多的糖蜜 1 糖蜜加水稀释至 15 17 oBx 2 加 0 5 按糖蜜重量计 工业用浓硫酸和 0 5 磷酸 磷酸按 45 计 澄清 16 24 小时 清液加热通风后 加石灰乳使 pH 至 4 8 5 1 再澄清 16 24 小时备用 4 糖蜜的检测 糖蜜处理前应检测的指标 锤度 水份 灰份 总发酵糖 还原糖 糖蜜处理后应检测的指标 锤度 灰份 胶体 总还原糖 处理方法见附录 1 第四章 酵母生产工艺流程 在进入酵母生产之前 首先必须熟悉相关的发酵设备的操作规程和注意 事项 相关内容见附录 2 一 一 酵母发酵工艺原理酵母发酵工艺原理 工艺的基本要求 1 种子质量 A PH 值 B 细胞浓度 以每毫升多少个细胞表示或以 OD 值表示 C 镜检状况 D 种龄 2 接种量 3 发酵温度 4 发酵 PH 值 5 通风比 1 5 2 5 6 流加时残糖 10 13h 7 发酵周期 8 发酵结束时细胞浓度 以每毫升多少个细胞表示或以 OD 值表示 9 发酵结束镜检状况 10 放罐时残糖1 50g 湿酵母 g 蔗糖 12 初步成本计算 元 吨湿酵母 含水 75 13 放罐体积 7L 把一定量的种子酵母接种到培养液内进行生长繁殖 并连续加入培养液 和通入空气控制一定 pH 和温度 经过 8 12 小时的通风流加满罐后 发酵成 熟送去分离收集酵母 通风流加法间歇生产酵母的培养过程分为四个时期 1 酵母的适应期 前发酵期 酵母菌种加入发酵罐由静止状态到出芽状态需要一个适应的时期 在酵 母细胞的原生质内发生复杂的生化过程 当酵母菌种和培养基混合时 酵母立 刻吸收其中的养分 培养基中约 50 的糖分可以进入细胞 在适应期结束时 酵母具备了形成芽体的能力 2 酵母的繁殖期 生长对数期 将糖液和营养液继续加入发酵罐 同时提高通气量 酵母的数量迅速增 加 在最初的 2 3 小时 酵母出芽旺盛 酵母成族存在 很少见到衰老细胞 在以后的 2 3 小时内 酵母出芽能力仍然旺盛 但有一些细胞已停止出芽 衰老 酵母形态以成双为主 少数以单个存在 3 酵母的成熟期 稳定期 在最后的 2 3 小时内 酵母的出芽率下降 衰老细胞和幼小的细胞都 积聚在培养基内 酵母数量增长放慢 其原因是 酵母密度大 耗氧大 而氧 的供应不能满足需要 在培养基中某种养分耗竭 酵母的生长受到限制 酵母代谢副产物积聚在培养基内 妨碍酵母的生长 在成熟期 衰老细胞和幼小细胞共存 衰老细胞中有大的空泡 容易在 溶解氧高时发生自溶 所以需要降低通风量 二 酵母生产工艺流程二 酵母生产工艺流程 1 糖蜜处理 糖蜜 称量 加水稀释 加硫酸 磷酸 加热煮沸 通风 加石灰调 pH 澄 清 16 24 小时 备用 2 营养盐配制 磷酸 硫酸镁 硫酸铵称量 加水溶解 调 pH 备用 12 注 盐的用量自行查阅资料确定 参考用量为磷酸盐 0 05 硫酸镁 0 04 0 05 硫酸铵 0 3 4 菌种扩大培养 首先要求根据接种量确定所需种子液的总体积 在实验操作过程中根据下 述工艺扩培的比例关系 或放大 或缩小 酵母菌种 10ml 麦芽汁培养 100ml 麦芽汁培养 300ml 麦芽汁 300ml 糖蜜 培养 发酵罐种子 5 发酵罐发酵 糖蜜培养基 通风 种子 发酵罐 糖蜜培养基流加 发酵 10 12 小时 成熟 放罐 离心分离 酵母洗涤 常温真空干燥 干酵母 三 发酵工艺条件三 发酵工艺条件 发酵时间 10 12 小时 温度 30 33 浓度 8 10 oBx 酸碱度 PH 4 2 4 5 残糖 还原糖 03 0 5 克 100ml 风量 1 5 2 5 m3 m3发酵液 分 四 发酵工艺操作四 发酵工艺操作 先在发酵罐内加入最终稀释糖液要求达到基液浓度时所需总水量的 60 70 注意 要求加入水量盖过温度测量探针 加入 10 糖液 对总量计 10 营养液 对总量 实罐灭菌冷却 接种酵母 按表 1 1 进行通风 流加 培养基 每 2 小时取一次样分析残糖和菌体浓度及镜检 检验方法见附录 3 流加完毕后 继续通风 1 小时 发酵成熟 表 1 1 发酵条件控制 项目编号 发酵时间小时糖液 营养盐 风量m3 m3发酵液 分 发酵前 01010 开始发酵 10 1551 21 25101 5 32 310152 43 412152 2 5 54 512152 5 65 612152 5 76 712102 5 13 87 81252 5 98 9102 109 102 总计10 小时100 100 发酵流加培养基 1 9 号分别按上表比例量取糖液和营养液混合后分装入 250 毫升三角瓶中 115 20 分钟灭菌 冷却 备用 另外 以上表格仅供参考 要求学生自 行设计补料量和补料次数 般 1 2 次 开始投料问题要求盖过发热棒和温度计 大约需要 5L 采样 从发酵第四小时开始采样 检测酵母细胞数 酵母细胞大小 酵 母染色率 发酵液的浓度等项目 做好记录 绘制酵母生长曲线图 五 酵母的五 酵母的产品质量控制产品质量控制 酵母的质量标准包括酵母的色泽 气味 杂质 水分 发酵力等 5 个方 面 发酵完后 要查阅相关资料 确定产品上述参数的分析方法 并分析酵母 产品的质量 活性干酵母 Active Dry Yeast 是一种具有发酵活性的干生物制剂 实质 是 没有生命活动但同时又是活着的生物 它具有发酵能力 含水分低 保藏时间长 运输 使用方便等优点 广泛地应用于面包 葡萄酒 酒精生产 一 一 酵母的分离和洗涤目的 酵母的分离和洗涤目的 发酵结束后 应在很短时间内把酵母从发酵醪中分离出来 用 1 2 倍 的自来水洗涤分离浓缩的酵母乳 2 3 次 以除去酵母分泌的代谢产物 杂菌 细菌 和酵母细胞表面吸附的色素等物 从而使分离浓缩的酵母乳成为 12 16 浓度的乳白色至乳白黄色 酵母分离机分离的性能 转速 3000 6000 转 分 二 二 酵母的压榨 酵母的压榨 经过酵母分离机分离洗涤的酵母乳 为含水分在 85 左右的流动性液体 如需要较长时间的储藏 必须使酵母乳压榨成含水分 70 的固体酵母 才能便 于储藏 酵母的压榨使用板框过滤机 三 三 酵母的干燥 酵母的干燥 1 干酵母干燥 利用真空干燥箱干燥 2 干酵母质量标准 色泽 淡黄至淡黄色 气味 具有酵母的特殊气味 无败臭味 杂质 无异物 粒度 颗粒 14 第五章 酵母片压片工艺流程第五章 酵母片压片工艺流程 一 干酵母片 Tabellae Saccharomycetis Sicci 的处方 本品含蛋白质应为干酵母标示量的 38 以上 常用制品 每片含干酶母 1 0 3g 2 0 5g 原料与用量 每 100 片用量 干酵母粉 30 g 氢氧化铝 l g 砂糖 18 62 g 饴糖 0 5 g 香料滑石粉 1 g 滑石粉 1 g 硬脂酸镁 0 08g 二 制法 将饴糖加入砂糖中一起磨粉 过 80 目筛 加入其它原辅料粉子 混合均匀 过 40 目筛 然后压片 即得 1 干醉母粉的形状对片剂成型有很大影响 对粉末直接压片影响更大 球 形酵母弹性大 易产生顶裂现象 所以多选择多边形酵母粉为原料 2 本品除可用氢氧化铝 饴糖 砂糖 滑石粉做干粘合剂和助流剂外 还 可以选择羧甲基纤维素 CMC 糖粉 黄糊精做干粘合剂 用氢氧化铝 三硅 酸镁或铝镁原粉 药用 做助流剂 进行粉末直接压片 3 香料滑石粉配方 滑石粉 1000g 柠檬香精 8g 桔子香精 8g 香草香精 60g 混合均匀 过 16 目筛备用 三 单冲压片机的安装与调试 单冲压片机是实验室常用的小型压 15 片机械 图 1 构造 简单 使用方便 其 安装与调试过程如下 首先装好下冲头 旋 紧下冲固定螺丝 旋 动片重调节器 使下 冲在较低的部位 再 将模圈装入模板 族 紧模圈固定螺丝 然 后仔细地将模板固定 在机座上 冲头的周 边锋利部位容易因碰 撞而损坏 故在整个 装拆过程中都应小心 调节出片调节器 使下冲头上升到恰与模圈相齐平 再装上冲并旋紧上冲固定螺丝 转动压力调节器 使上冲处在压力低的部位 缓慢地用手摇转压片机的转轮使上冲逐渐下降 观察其是否正好在冲模的中心 位置 如不在中心位置 应上升上冲头 不得将上冲头强制地冲入模孔 更不 应使上下冲相接 稍微松动一点模板固定螺丝 移动模板位置直至上冲头恰 在模圈模孔的中心位置 旋紧固定螺丝 装好饲料靴和加料斗 并加入颗粒 用手转动转轮 如感到不易转动时 不得用力硬转 应小心倒转少许 然后旋 动压力调节器使之适当上升减小压力 称其平均片重 调节片重调节器 使压 出的片重与应压片重相等 同时调节压力调节器 使压出的片剂有一定的硬度 在上述一切操作均较顺利后 开动电动机进行试压 枪查片重和崩解时间 达 到要求后方可正式压片 单冲压片机压片过程如图 2 所示 压片机有一定 转向 不得反向运转 否则将会损坏机件 单冲压片机压制的片剂硬度不高 切忌为提高硬度而盲目增加压力 在过高压力下 压力调动器中心活动螺杆很 容易弯曲损坏 压片机的保养 压片完毕 用毛刷刷去药粉 用废纱头揩 拭机件 使压片机干燥清洁 最后加好润滑油 下次使用前仍应用手缓缓转动 转轮 仔细观察压片机是否有故障 当一切正常后 方可开启使用 若需拆卸 时 拆下的次序与安装次序恰好相反 生物制药分析复习题 2002 级 第 1 3 章 绪论 1 名词解释 药物 生物药物 生化药物 生物技术药物 生物制品 标准品 精密度 2 药物分析的性质 任务 3 什么是药典 解放以来 我国共出版了几部药典 可供 参考的国外药典主要有哪些 4 中国生物制品规程 2000 版系建国以来的第几版 分 几部 5 药物分析所采用的标准物质分几类 6 生物药物质量检验工作的基本程序 7 精密称定与精密量取各指什么 第 4 章 酶法分析 1 酶分析法包括的两种类型 2 酶法分析的定义 分类 用途 16 四 片剂质量检查 1 片剂外观 应完整光洁 色泽均匀 有适宜的硬度 以免在包装贮运 过程中发生碎片 2 重量差异 片剂重量差异的限度规定如下 平均重量 0 30 g 以下的重 量差异限度为 7 5 0 30 g 或 0 30g 以上的为 5 检查法 取药片 20 片 精密称定总重量 求得平均片重后 再分别精密 称定各片的重量 将每片重量与平均片重相比较 凡无含量测定的片剂 每片 重量应与标示片重比较 超出重量差异限度的药片不得多于 2 片 并不得有 l 片超出限度的一倍 参参 考考 书书 目目 1 甜菜糖厂 三废 处理及综合利用 郭成勋主编 轻工业出版社 1990 2 酵母生产技术知识 上海市食品工业公司编 1986 17 3 甘蔗与糖品的综合利用和深加工 保国裕等编著 广东省制糖 学会出版 1989 附录附录 1 糖蜜处理后质量分析 糖蜜处理后质量分析 1 糖蜜中胶体含量分析 1 原理 糖蜜的胶体用酒精使之沉淀 然后过滤 干燥 称重的方法进行测定 糖蜜中的胶体主要是多缩树胶糖和蔗糖分解产物 与氨基酸聚合而成的黑 蛋白胶 它是一种亲水性胶体 利用乙醇能除去亲水性胶体稳定的水膜 使之 凝聚 加入乙醇之前 先将样品调至酸性 一方面避免在碱性溶液中蔗糖盐与 胶体一起沉出 另一方面把溶液调节至胶体的等电点 约 pH4 4 5 使胶体更 易沉淀出来 2 试剂 a 0 1N 盐酸溶液 配制方法请自查资料 b 95 酒精 90 酒精 配制方法请自查资料 c 奈酚溶液 摩里土试剂 称取 奈酚 5 克 用 95 乙醇溶解为 100 毫升 于棕色瓶中暗处保存 d 浓硫酸 3 测定方法 精确称取糖蜜试样 15 克 用水稀释至 100 毫升 摇匀后 过滤 吸取滤 液 5 毫升与 250 毫升三角瓶中 用 0 1N 盐酸溶液调节至 pH4 4 5 加入 95 酒精 45 毫升 并安装上回流冷凝管 在沸水浴上加热 15 分钟 用已于 100 干燥至恒重的干滤纸过滤 沉淀用 90 酒精充分洗涤至溶液与 奈酚不起紫 色反应 奈酚是鉴别糖类的试剂 糖在浓硫酸存在下脱水生成糖醛或其衍 生物 再与 奈酚反应生成紫色化合物 借以检查残糖的存在 鉴别过程 取滤液约 3 毫升 滴 奈酚溶液 3 滴 摇匀后将试管倾斜 沿管壁缓缓加 入浓硫酸 1 2 毫升 在硫酸与滤液两介面如出现紫色环时 证明有糖类存在 为止 沉淀物连同滤纸放在已于 100 干燥至恒重的器皿内再在 100 烘箱 烘干 直至恒重 4 计算 总胶体含量 克 100 克 G G1 G2 100 100 15 5 式中 G 干燥后连同器皿 滤纸与沉定物的总重量 克 18 G1 器皿的重量 克 G2 滤纸的重量 克 2 处理成本计算 在工业中使糖蜜的根本出发点就是为了降低成本 因此必须要求糖蜜处理 成本加上购买糖蜜的花费小于其它可代替发酵糖 主要是蔗糖或淀粉糖 的花 费 否则就达不到降低成本的目的 糖密处理成本的计算主要包括以下内容 a 处理的试剂费 b 处理的水电费 c 处理所需的人工费 d 其它因定资产折旧 附录附录 2 发酵罐操作使用规程 发酵罐操作使用规程 一 一 发酵系统组成发酵系统组成 1 组成 发酵设备由电热锅炉 空气压缩机 发酵罐 控制柜 管道组成 一个典型的发酵控制系统由罐体 空气除菌过滤系统 蒸汽灭菌系统 温度测量系统 pH 测量系统 溶解氧测量系统等部分组成 空气除菌过滤系统 空气压缩机 储气罐 冷干机 一级预过滤 金属膜过滤器 两个串 联 发酵罐 排气 由压力表和空气流量计控制进气和排气量的大小 蒸汽灭菌系统 电热锅炉产生蒸汽 减压阀 0 13Mpa 管道 发酵罐 冷凝 水 进入夹套时 或在发酵液中 直接通入发酵液时 2 主要技术参数 1 发酵罐 10L 灭菌压力 0 15Mpa 工作压力 0 05 0 07Mpa 灭菌温度 121 125 转速 无级调速 罐温 仪表显示 2 空气压力 0 2Mpa 二 使用说明 19 1 上岗前的技术培训 SFM 10L 发酵罐是机电一体化的设备 因此 操作人员上岗前须熟悉 设备的性能 整个系统的工作原理 管路 阀门的操作程序 进行必要的培训 能正确使用设备 未经培训的人员 不得单独上岗操作 未经培训的人员 不得单独上岗操作 2 开机前的准备工作 1 旋开 SFM 10L 发酵罐的接种口盖 打开视镜灯电源 观察罐内 是否有杂物 通风 取样管是否在正常位置 搅拌叶轮是否脱落 有异常需调 整好 2 检查电源是否正常 搅拌电机 空压机能否正常工作 3 拧紧发酵罐接种口盖 4 检查系统上的阀门是否在正确位置 接种口及紧固螺钉是否拧紧 阀门是否在正确位置 接种口及紧固螺钉是否拧紧 5 开动空压机 用 0 15 Mpa 压力 检查发酵罐 过滤器 管路 阀 门的密封性能是否良好 6 检查温度仪 变频调速器是否正常 3 空消 投料前 无菌空气管路 发酵罐内壁及其附属管路阀门必须用蒸汽进行 灭菌 消除所有死角的杂菌 保证系统处于无菌状态 一 空气管路的空消 关紧空气预过滤器和总过滤器之间的阀门 切勿忘掉 因为预过滤器预过滤器 不能受高温不能受高温 调整好蒸汽压力 使其在 0 13 0 15 Mpa 之间 缓慢打开蒸汽过滤器前的蒸汽阀门 按照蒸汽进入的次序依次打开过滤器下面的排气阀门 排除管道中冷凝水后 关小各过滤器的排气阀门 使蒸汽通过各分过 滤器 对其进行灭菌 灭菌时间持续 40 分钟左右 空气管路灭菌完成后 依次关闭各分过滤器的排气阀门 最后关闭进关闭进 入空气管路的蒸汽总阀入空气管路的蒸汽总阀 二 发酵罐及其附属管道的空消 检查夹套内的冷却水是否排尽 取出 PH 和溶氧电极 它 20 们不能经受高温 而控温仪不需要 并用封盖封好插口 拆开排气阀与空气流量计之间的软管 打开罐两边的蒸汽 以及下面的进阀门 使蒸汽直接进入罐内 微开 接种口 打开排气阀使蒸汽通过这些阀门排出 当罐温超过 100 时可以关小排气阀 直到罐压达到 0 13 0 15 Mpa 关小蒸汽进汽阀 保持罐压为 0 13 0 15 Mpa 温度 120 125 维持时间 30 40 分钟 空消结束后 打开排气阀 使罐压力与大气压相同 防止突然冷却罐空消结束后 打开排气阀 使罐压力与大气压相同 防止突然冷却罐 内产生负压 损坏设备 内产生负压 损坏设备 逐个关上所有的蒸汽阀门 打开空气阀门 吹干空气分过滤器和发酵 罐 20 30 分钟 然后将排气阀门和进气阀关闭 使空气系统保持正压 备用 4 实消 实消是当罐内加入培养基后 用蒸汽对培养基进行灭菌的过程 培养基的量一般以罐体全容积的 70 左右为宜 泡沫多的培养基需加入 少量消泡剂 考虑到冷凝水和接种量因素 加水一般为罐体全容积的 60 左右 从接种口加入起始培养基 开启机械搅拌装置 使罐内物料均匀混合 转速 50 100rpm 先开启夹套蒸汽阀门对罐内培养基预热 当罐温升到 80 时 关夹 套蒸汽阀门 打开罐内所有蒸汽进汽阀 通入蒸汽 当罐温上升到 105 时 缓缓打开排汽阀 将罐顶冷空气排掉 持续 5 分钟后 调小 排汽阀排汽量 当罐压升至 0 12Mpa 温度升到 121 123 时 控制进汽阀门开度 保持罐压不变 20 分钟后从罐底排污阀排掉一点培养基 防止罐底死 角 并关上 关死蒸汽阀门和排汽阀门 当发酵罐压小于进气气压时 打开空气进 气阀门 同时微开排汽阀门以维持罐内正压 利用夹套通水冷却发酵液 即打开夹套的进水阀门和排水阀门 调节空气进气阀和罐顶排气阀 保持罐压为 0 05 Mpa 直到罐温降至 接种温度 21 5 发酵罐接种和营养液的流加 本设备采用火焰口接种 流加 应事先准备好酒精 棉花 钳子和接种 环 菌种 培养基分别装入三角瓶内 并保持无菌状态 接种量 流加量根据 工艺要求确定 将酒精棉花围在接种口周围点燃 用钳子或铁棒拧开接种口 此时罐内 压力应排至 0 Mpa 并向罐内通气 使接种口空气排出 保证无菌状态 防止 空气倒流 将三角瓶的菌种 流加培养基在火环中间无菌区内倒入罐内 动作要协 调 无菌操作要规范 接种 流加完毕 将接种口盖在火焰上灭菌后拧紧 熄灭火环 接种后即可通气培养 罐压保持在 0 05 Mpa 另外还有工艺要求的通 气量和温度控制 接上流量计与排气口上的软管 调整好通风量 调整好培养温度 并按规定做好原始记录 6 取样 发酵中间过程取样时 开蒸汽阀对取样管灭菌 5 分钟 关闭蒸汽阀 保持罐压 0 1 Mpa 打开取样阀 发酵液流入小烧杯 开始流出部分弃取 7 放罐 发酵结束 用蒸汽对出料管灭菌 关闭蒸汽阀 打开排料阀 排出发酵液 排料结束应立即清洗发酵罐 防止发酵物料沉积在管路 阀门及罐壁上 清洗 完毕 开空气阀将管路 阀门及发酵罐吹干 附录附录 3 酵母生产中的检验和分析 酵母生产中的检验和分析 在发酵过程中 酵母和发酵基质都在发生变化 酵母数量增加 大小形态 也随环境基质的改变而改变 发酵基质在支持酵母生长的同时 其中的营养成 分也逐渐消耗 然而 要确切地评价原料利用率的高低 酵母质量的好坏 发 酵工艺的水平以及发酵的经济效益 就需要用数据来说明 而不是依靠模糊的 叙述 获得数据的办法 就是在发酵生产中进行一系列分析化验工作 通过分 析检验 第一 可以把好原料质量验收关 第二 可以实行生产过程的监控和 管理 降低产品的不合格率 第三 加强产品质量管理 保证产品符合国家行 业标准 第四 为生产工艺优化提供数据 22 发酵生产中依据分析对象不同可分为两大类 酵母的检测和发酵基质的分 析 其中酵母的检测内容有 发酵过程中酵母的形态变化 发酵液中酵母 量的测定 包括以个数表示 个 ml 和重量表示 g ml 发酵过程中酵母 的活性分析 酵母产品质量评定等 而发酵基质的分析内容有 原料和发酵 液中的糖分测定 发酵液的 PH 和酸度测定 发酵基质中氨氮 氨基氮测 定 发酵液中其他重要营养成分的测定 由于分析化验的种类和技术并不是一蹴而就 短时期内就固定下来的 而 是在不断地扩大和完善的 上述的分析项目也处于变化中 分析人员可以根据 厂里的状况对分析项目进行选择和增减 第一部分 酵母的检测第一部分 酵母的检测 主要介绍酵母的定性的观察和定量测定方法 内容包括 酵母形态的观察 酵母细胞数和出芽率的测定 发酵液中酵母的湿含量 酵母死亡率的测定 酵母细胞大小的测定 一 一 酵母形态的观察酵母形态的观察 1 酵母菌的菌落特征 酵母在固体培养基上生长 往往聚集在一起 形成一定形状的细胞群体 称酵母菌落 菌落表面一般是光滑 湿润及粘稠的 也有粗糙带粉粒的 或有 皱褶的 边缘整齐 或带丝状 菌落较大 较厚 大多数不透明 呈油脂状或 蜡脂状 当菌落呈白色 奶油色或生长时间较长时 其外形逐渐生皱及变干 颜色也往往变暗 酵母菌的菌落特征是鉴定酵母菌的依据之一 2 镜检操作程序 斜面培养酵母的制片 取干净的载玻片 在中央滴加一小滴蒸馏 水或无菌水 用无菌操作的程序 使用接种环从斜面试管中取出一环 酵母菌与水混合均匀 取一盖玻片 使盖玻片的一边与菌液接触 然 后慢慢放下 要注意避免在盖玻片和载玻片之间产生气泡 盖玻片 边缘多余的水液可用吸水纸吸干 制片完成 液体培养酵母的制片 取干净的载玻片 用无菌操作的方法 使 用接种环从液体酵母中取一环置于载玻片中央 再盖上盖玻片即可 观察 把制好的载玻片置于显微镜载物上 先用低倍镜观察 23 倍物镜 待找到焦点后 再用高倍镜观察 倍物镜 3 结果分析 酵母细胞形态的检查在生产上是很重要的 在分类学上也有一定 的意义 菌种选育时 也将其作为一个指标 酵母细胞的形态往往 受环境影响而变化 因此有一定的对比性 各种条件应该统一 一 般成熟的细胞大于幼龄细胞 液体培养的酵母大于固体培养的酵母 酵母的形态有球形 椭圆形 圆柱形 腊肠形 端尖状 一端拱 形 三角形等 本次实验使用的酵母 在显微镜下应呈圆形或椭园 形 大小均匀 如果出现拉长是不正常现象 年幼的细胞因细胞膜薄 细胞内部充满细胞质 显得厚而均匀 老熟酵母细胞内出现空泡 内溶物成颗粒状 在酵母生产的过程中 酵母菌从试管的斜面种扩大成液体三角瓶 种 到发酵罐发酵 在这层层扩大的过程中必须经过多次的抽样镜 检观察来确定酵母生产质量 二 酵母细胞的计数和发芽率的测定二 酵母细胞的计数和发芽率的测定 掌握血球计数板的使用方法 学会测定酵母细胞总数和发芽率的方法 从而了解酵母的生长情况 1 实验材料及仪器 显微镜 血球计数板 载玻片 盖玻片 接种环 酒精灯 2 训练内容 血球计数板是一块比普通玻璃较厚的特制载玻片 见图 板的两边的 两个突出部分 突起部分为计数区 计数区中央的计数室有 个小方格 血球计数板分为两种 一种计数板的刻度是将每 个小格组成 个中格 共 计有 个中格 个中格为一个大格 此种计数板为 中格 小格 的规格 另一种计数板的刻度是将每 个小格组成一个中格 共计有 个中格 个中格为一个大格 此种计数板为 中格 小格 的规格 计数板中中格以双线分格 小格以单线分格 当把盖玻 片盖于计数室上时 空间的长宽各为 mm 高为 mm 所以计数室的体积 为 立方毫米的空间 24 样品的稀释 为了方便计数 对取出的样品可有蒸馏水或无菌水进行稀释 稀释程度以计数 板每小格内含有 个酵母为宜 稀释时可采有十倍系列连续稀释的方法 2 酵母菌细胞数的测定 先将计数板置于显微镜下用低倍镜观察 找到格子后 判断 是 还是 的规格 再将稀释后的发酵液用滴管吸取一滴样品滴加在计数板的计 数区中 用一盖玻片轻轻盖上 避免产气泡 用吸水纸吸去多余水 液 数分钟后 全部酵母细胞沉降到玻片表面 将计数板置显微 镜下计数 计数时 如果使用 的计数板 要按对角线方位取 左上 左下 右上 右下四个中格进行计数 即计数 个小格 中的酵母数 如果使用 的计数 则除了计数上述四个中 格外 还要计数中央的一个中格 即计数 个小格的酵母数 观察注意事项 a 计数时 对位于线上酵母菌 可采用只计数两条边的办法 如 只计数位于格子上方和右方两条线上的酵母细胞 b 酵母芽体达到母细胞大小的一半时 即可计作两个细胞 小于 一半为一个细胞 c 为了计数准确 应适当使用细调螺旋调节焦距 将处于不同深 度的酵母细胞都能计算在内 每个样品重复计数 次 按公式计算每毫升菌液所含酵母细胞数 填写下表 的计数板 100 个小格内酵母细胞数 酵母细胞数 ml 400 10000 稀释倍数 100 的计数板 80 个小格内酵母细胞数 酵母细胞数 ml 400 10000 稀释倍数 80 次数 1 2 3 平均值 中格序号 25 细胞数 细胞数 ml 发芽率的测定 可在测定酵母细胞总数时同时测定出芽的芽体数 一般如芽体大 于或等于母细胞一半时应将芽体视作单个细胞 不算为芽体 将小 于母细胞一半的芽体才计为出芽数 在单位体积内测定得酵母细胞的芽体数占总数的百分率 即为该 酵母的出芽率 芽体数 出芽率 细胞总数 填写下表 次数 平均值 中格序号 细胞数 芽体数 细胞数 ml 芽体数 ml 出芽率 三 发酵液中酵母量的测定 三 发酵液中酵母量的测定 本方法目的是了解酵母增殖情况 估计酵母产量 测定时用离心沉淀获 得湿酵母 操作步骤 取称重后的离心管 W1 量取发酵液 100 毫升于此离心管 内 在粗天平上平衡后 放入离心机内 以 3500 4000 转 分离心 15 分钟 取 出离心管慢慢倾去上层液体 然后称重 W2 杂质多时 可用水洗涤 并再 次离心 1 2 次 每 100 毫升内湿酵母含量 W2 W1 要确定离心分离酵母是否彻底 可以镜检废水中的酵母数 取 1 滴废水于 玻片上 盖上载玻片 用低倍显微镜观察 每个视野细胞数不超过 3 个 且细 胞一般为幼小的或刚从母体上脱离下来 酵母产品质量评定 分析项目见附表 1 酵母理化指标 QB596 82 四 酵母的死亡率测四 酵母的死亡率测定定 26 掌握鉴别酵母细胞死活的染色方法 了解辨别酵母死亡的原理 从而进 一步了解酵母的死活情况 1 实验原理 酵母细胞的死活鉴别 是利用美蓝 是一种弱的氧化剂 还 原后变为无色的性质进行的 如活的酵母细胞 由于新陈代谢 不断进行 能将美蓝还原为无色 而死的细胞却不能还原 染 成蓝色 但染色时需严格控制染色时间 2 实验材料及仪器 显微镜 载玻片 盖玻片 接种环 酒精灯 吕氏美蓝 注 吕氏美蓝的配制方法 美蓝 0 5 克 乙醇 30 毫升 蒸馏水 100 毫升 1 KOH 1 毫升 3 酵母菌死亡率的测定 取吕氏美蓝液一滴 滴加在载玻片中央 再取酵母菌菌液少 许 混入美蓝液中 搅拌均匀 染色 分钟 加盖玻片 在显微镜下检查 记录一个视野中 已变蓝的死细胞数和无色的活细胞数 依 法再计数 个视野中的细胞数 计算平均值 填入下表 平均值 活细胞数 死细胞数 在单位体积内 死亡的细胞数占总细胞数的百分率 即为死 亡率 根据公式计算死亡率 死细胞数 死亡率 活细胞数 第二部分 发酵基质的化验分析第二部分 发酵基质的化验分析 一 糖分分析一 糖分分析 1 糖蜜原料中的糖分分析 糖蜜是糖厂的副产物 其所含的糖分高低是糖蜜原料质量的重要指标 也是酵母生产中主要碳源 甘蔗糖蜜中的糖分主要含蔗糖和还原糖 由于蔗糖 无还原性 需要经酸水解转化成具有还原性的葡萄糖和果糖 然后利用还原糖 27 测定的方法得到糖蜜中的总糖分 TC Total Carbon 并不是所有的糖分都能 够为酵母所利用 其中还有一些不能为酵母所利用的还原性物质 称为非发酵 性还原物 NC Not usable Carbon 糖蜜中酵母所能够利用的糖分 UC Usable arbon 为 TC 和 NC 的差 由于 NC 的测定略微烦琐 其值一 般占 TC 的 所以糖蜜糖分经常以 TC 为参考 TC 的测定一般采用快 速测糖法 为了了解发酵过程中 酵母可利用的蔗糖与还原糖之间的比例关系 进 一步探索其对酵母生长过程的影响 所以 还需同时测定原料与发酵液中还原 糖化酶的含量 1 还原糖的测定 试剂配置 菲林氏甲液 硫酸铜 c p 15 克 次甲基蓝 0 05 克溶解后稀释到 1000 毫升 菲林氏乙液 酒石酸钾钠 c p 50 克 氢氧化钠 54 克 亚铁氢化钾 c p 4 克溶解后稀释到 1000 毫升 标准葡萄糖的配制 葡萄糖 c p 经过 105 烘至恒重 一般 4 小时 称取 1 克 溶解后稀释到 1000 毫升 其浓度即 1 1000 克 毫升 操作方法 空白实验 取菲林甲乙液各 5 毫升置于 100 毫升三角瓶中 加入适量 0 1 标 准葡萄糖液在电炉上加热至沸 然后以每 4 5 秒钟一滴的速度滴定到兰色 消失 记下耗 0 1 标准葡萄糖液 V0 毫升 一