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第六章 毛细管电泳仪* 绪言1、概念：在极细的毛细管内所进行的各种形式的电泳，称为毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)。2、类型：有毛细管区带电泳，胶束电动力学毛细管色谱、毛细管筛分电泳、毛细管等电聚焦电泳、毛细管等速电泳等。3、毛细管电泳特点：(1)高效、快速、微量、可全部自动化。(2)与高效液相色谱(HPLC)相比，毛细管电泳(CE)成本低，选择性大，且几乎不消耗溶剂。(3)散热效率高，分离质量好。(4)灵敏度和分辨率高，操作简便，污染小，应用范围广。4、历史发展：1967年：最先在3mm直径毛细管中作自由溶液的区带电泳。1974年：用200500mm内径的毛细管作电泳分离。1981年：用75mm内径玻璃毛细管柱，加30kV电压实现电泳。1984年：引入了胶束毛细管电动力学色谱的方法。1987年：实现了毛细管等电聚焦及毛细管凝胶电泳。1988年：首次利用CE作微量物质提取。并把激光引入CE检测器，大大提高了检测灵敏度。第一节 毛细管电泳的工作原理一、带电粒子的迁移 (一) 偶电层和Zeta势1、偶电层： 固体与液体接触时，若固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力会使其周围液体带有相反电荷，即在液-固界面形成偶电层，两者之间存在电位差，叫Zeta势。* 毛细管电泳中，带电粒子表面和毛细管壁表面都有偶电层。2、粒子的Zeta势： 电解质中的任何带电粒子被异性电荷的离子所包围，部分异性离子被吸附到粒子上，部分则游离在附近。被吸附的“固定”离子有一个切平面，和带电粒子间的电势差，称为粒子的Zeta势。3、管壁的偶电层和Zeta势：(1)偶电层：毛细管一般为石英管，内表面为硅胶表面并带负电(pH3) 。则管子中溶液的正离子因受静电引力就会聚集紧贴在表面附近，从而形成偶电层。(2)Stern层：偶电层中由于吸附而紧贴在表面的离子叫Stern层；其它可移动的游离离子为扩散层，游离离子的电荷密度随与表面距离增大而急剧减小。(3)管壁的Zeta势：Stem层和管壁表面间的电势差称为管壁的Zeta势。* 偶电层的厚度d： 管壁的Zeta势随与管壁表面距离增大而按指数规律衰减，使其衰减一个指数单位所需的距离叫偶电层的厚度d。(二) 恒定场强下带电粒子的迁移1、带电粒子移动速度vep：电泳时，vep为 vep=mepE 式中mep为带电粒子的迁移率，E为场强。2、粒子的迁移率mep：在充满自由溶液的开口管中，mep为 mmep=exi/4phph 式中e是流体的介电常量，h是介质的粘度。xi是粒子的zeta电势。3、影响xi的因素：(1)表面电荷越大，xi越大。(2)如果电荷给定，则质量越大，xi越小。(3)对非胶体粒子，xi近似正比于(Z/M)2/3。(M、Z分别是粒子的分子量和净电荷)(三) 电渗1、概念：指高电场下由偶电层中水合阳离子或质子所引起的流体朝负极方向运动的现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF）。2、电渗的迁移率： mmeo=exw/4phh 其中xxw为管壁的Zeta势。* 电渗流的速度： veo=meoE=exwE/4ph 上式与电泳的迁移率和电泳移动速度类似。3、影响电渗因素：管壁的Zeta势越大，偶电层越薄，介质粘度越小，电渗流速就越大。 通常电渗流速是电泳流速的57倍。4、带电粒子运动速度v和迁移率mm ：因毛细管内同时存在着电泳和电渗，不考虑它们的相互作用，则 v=vep+veo=(mep+meo)E式中 Ld是毛细管从进样口到检测器的距离， tr是粒子通过该距离所用的时间， Lt是毛细管柱的全长， U是电压，E=U/Lt。5、粒子移动特点：因电渗流从阳极流向阴极，所以 正离子：运动方向和电渗一致，故它最先流出毛细管。 中性粒子：其电泳速度为“零”，故它随电渗而移动。 负离子：运动方向和电渗相反，故当电渗流速大于电泳流速时，它在中性粒子之后流出毛细管；电渗流速小于电泳流速时，则它将无法流出。6、控制电渗流的不同方法：(四) 梯度场强下带电粒子的迁移 * 恒定场强下的毛细管电泳，某组分区带的移动速度： dx/dt=mE 式中m为该组分在场强E下的迁移率，是指电渗和电泳两者移动速度的代数和。 * 梯度场强下的毛细管电泳，因场强是时间的函数，即： E=E(t) 故在一段时间内某一组分在管柱内移动的距离为： 二、影响谱带展宽的因素 (一) 几个概念1、柱效和塔板高度因CE和色谱技术很相似，故电泳谱带展宽可直接沿用色谱的塔片高度和柱效的概念作为指标。 * 理论塔扳数N：指虚拟的塔板的数量。即把色谱柱近似看成精馏塔，以虚拟的塔板数的多少来衡量分离效率的高低。 N可从分离结果的色谱图直接计算，即： N=5.54(tt/W)2 式中 tt称为保留时间，即流出曲线最高点所对应的时间； W叫半峰宽，即峰高一半处的宽度。 * 单位塔板的高度：H=L/N 这里L是柱长。2、流型： 电渗是流体相对于带电管壁的移动，即带电的外壳离子把电渗力传递进去使流体移动。当电渗力与粘滞力平衡时，整个流体像一个塞子一样匀速前进，整个流型呈扁平型的塞子流(谱带展宽很小)。这是CE的理想状态。* 直径小于200mm的毛细管中，这种流型不受管径的影响。* 在这种流型电泳中，反映柱效高低的塔板数为： N=vLd/2D=mELd/2D 式中v和m为带电粒子的运动速度和迁移率， Ld为进样口到检测器的距离， D为溶质的扩散系数， E为场强。(二) 影响谱带展宽的原因：有两类。 是来源于溶液和溶质本身，如自热、扩散和吸附。 是来源于系统，如进样和检测等。1、自热(1) 电解质溶液在高电场下会产生焦耳热，散热过程中，在毛细管内形成径向温度梯度（中心温度高），破坏了扁平塞子流型，导致谱带展宽。(2) 管径大，电阻小，电流大，产生焦耳热多，且不易散热。(3) 抑制焦耳热和温度梯度的方法：见下表。2、扩散和吸附(1) 扩散：是物质分子由高浓度区域自发迁移到低浓度区域的输运过程。扩散会引起谱带的展宽。 扩散系数D小的物质，展宽程度较小。(2) 吸附：溶质与毛细管壁间存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽。 * 吸附原因： 是阳离子溶质和带负电管壁的离子相互作用。 是存在疏水相互作用。 蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。 * 特点：细内径毛细管柱，有利于散热，但比表面积大(柱内表面积和体积之比)会使吸附增加，引起组分谱带的展宽也越大，故须尽可能抑制。第二节 毛细管电泳仪基本结构 * 由高压电源、毛细管柱、检测器，两个缓冲液槽，及记录装置组成。记录装置可为记录仪、积分仪，或是有控制功能的计算机工作站。CE的分离过程是在毛细管内完成的，故毛细管是核心部件，下面就毛细管柱的尺寸、形状和材料作介绍。一、毛细管柱： 一般为圆管型。应是化学和电惰性的，可透光，有一定柔性，易于弯曲。1、材料：(1)聚四氟乙烯：可透紫外光，电渗很弱。缺点是管子内径不均，对样品有吸附，热传导差等。(2)玻璃：电渗最强，但有杂质。(3)石英：最常用，分天然和人造两类，基本成分是二氧化硅。2、内径：内径140mm以下散热较好，目前使用的多在2575mm。* 细管柱优点：(1)可减小电流，即减少自热。 (2)散热快，可保持电渗流流型的扁平性及分离的高效。缺点：(1)不利于抑制吸附。 (2)进样、检测和清洗困难。3、长度：由塔板数公式N=mELd/2D知：(1) 场强恒定时，塔板数与柱长成正比。但柱长不能无限增加，因要使场强恒定，柱两端须增加电压。(2) 电压恒定时，柱长增加，可减少自热。但会降低场强，增加分析时间。 * 常用柱长约30cm。4、管壁厚度： 壁厚有两部分，包括石英本身和外面的涂层(热导率很低的聚酰亚胺)。 通常有两种规格，厚壁的石英管外径375mm，薄壁的外径150mm。一般厚壁管可改善散热。二、检测器： 有紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器、电化学检测器、拉曼光谱检测器等；前两种使用最广。(一)紫外检测器：1、原理：入射紫外光通过样品时，被吸收的多少符合朗伯-比耳定律。 检测点在靠近末端的管柱上，检测点管子的外涂层要烧掉。2 、例子：如图为HPE-100型紫外检测器原理。样品光6和参比光7相对比，可知样品吸收了多少紫外光。3、三种紫外检测方法固定波长：光源为低紫外氘灯，用滤光片获固定波长的光。可变波长：光源为氘灯或钨灯，用单色器(棱镜或光栅)获连续可调波长的光。快速扫描：有两类，其一用线性二极管阵列装置快速捕获紫外光，另一则利用硅光电倍增管作快速扫描。(二)荧光检测器1、原理：多原子分子吸收光子时，电子从基态跃迁到高能态，然后分子通过无辐射过程弛豫到最低激发态，并在回到基态时发射出光子，称为荧光。2、光源：激发用的辐射光为紫外光或激光。因激光单色性好，故容易校准和减小光散射，可大大提高检测灵敏度。 * 常用波长325nm的氦镉(He-Cd)激光光源。3、方法：检测也是在管柱上进行，管子的外涂层要除掉。4、应用：在DNA序列测定的CE中广泛使用。但对不能发射天然荧光的化合物，须预先加荧光剂。(三)电化学检测器 用来监测电泳毛细管中的流出物。1、原理：根据检测原理不同，分成电位检测器、电导检测器或安培(电流)检测器等。2、类型：CE中使用的电化学检测器有安培型和伏安型两种。安培型较简单，使用较多。(四)质谱检测器1、原理：是将待测物分子转成带电粒子，再用恒定磁场使带电粒子按质量大小顺序分离，形成有规则的质量谱。2、特点：对单一组分有很强的鉴别能力。对复杂大分子混合物的分离极强。3、种类：有很多，其中电喷射离子质谱对蛋白质的鉴别特别有用。(五)拉曼光谱检测器1、原理：单色光照射被分析物质，通过拉曼技术可控制散射光，使其在返回它原来位置时作全方位的重新发射。入射光和散射光之间的频差，一般落在中红外区。2、光源：为40mW的He-Cd激光发生器。在422nm处发射激光，在471.2nm处监控散射光。(六)间接检测： 包括间接紫外、间接荧光、间接安培检测等。* 间接紫外检测： 方法：缓冲液中加少量在紫外区有吸收的化合物，称为间接试剂，使之产生很高的本底。当无紫外吸收的离子通过窗口时，从而产生一个负峰。 缺点：灵敏度比直接检测低12个数量级。(七)小结： 各种不同的检测方法比较：三、进样因毛细管直径很小，故进样技术要求很高；现在很多CE仪器都配有自动进样装置。进样时应满足两方面的要求： (1)进样时不能引入显著的区带扩张； (2)样品量必须很少，否则易造成过载。 下面介绍几种进样的原理和方法。(一) 电迁移进样 也叫电动力学进样。1、方法：毛细管的阳极端，在接触缓冲液前，先直接置于样品溶液，并在很短时间内加进样电压，使样品通过电迁移进入毛细管。 这时的电迁移是电泳和电渗的综合结果。进样量通过改变进样电压和时间进行控制。2、特点：(1)电迁移进样装置简单，不需附加设备，介质粘度很高时使用更加有利。(2)电迁移是凝胶电泳进样的唯一方式。因为在凝胶状态下，压力进样很困难。(3)电进样可用于痕量富集。但样品溶液的离子强度必须保持恒定，否则在该点的电压会急剧变化。(二) 流体动力学进样 也叫压差进样。是最常用的进样方法。1、方法：有三种。(1)是在进样端加压。(2)是在出口端减压。(3)是调节进样槽和出口槽之间的高度使之产生虹吸作用，将样品引入。根据管内流体的伯努利方程可推得进样量公式：即流体动力学的进样量Q与毛细管两端的压强差DP、样品的浓度c、进样时间ti及管径r的4次方成正比，与粘度h及管长Lt成反比。2、特点：(1)若严控样品的粘度和温度，则进入毛细管的物质量恒定。(2)在进样中没有组分歧视。(三)毛细管电泳进样的若干注意事项1、毛细管插入样品溶液后，应立即开始进样操作。完成后迅速移至缓冲液中开始电泳。 否则会产生毛细作用及虹吸现象，引起误差并使谱带展宽。2、电极不要和毛细管接触。样品贮器和缓冲液贮器液面的高度应保持平衡。3、进样区带宜越小越好，否则会使柱效和分离度降低。故进样时间以短为宜。4、温度会影响进样量的恒定，因温度直接影响到粘度。5、样品溶液中的溶剂必须与缓冲液互溶，另外前者的离子强度应低于后者。6、注意防止溶液和缓冲液的蒸发和损耗。第三节 毛细管电泳类型和方法 有毛细管区带电泳，胶束电动力学毛细管色谱，毛细管筛分电泳，等电聚焦毛细管电泳和等速电泳，毛细管电色谱等。一、毛细管区带电泳： 也叫毛细管自由溶液区带电泳，是最基本和应用最广的方法。有关电泳讨论中除特别说明外，一般都是指区带电泳。二、胶束电动力学毛细管色谱(MECC)：1、特点：使CE可在进行离子型化合物分离的同时，进行中性物质的分离。2、胶束概念：将浓度足够大的离子型表面活性剂加入缓冲液中，则表面活性剂的单体会结合在一起形成一个球体，称为胶束。其形成是疏水效应的结果。3、胶束分类：有正相和反相胶束两类。常用带负电荷的正相胶束。4、MECC原理：(1)系统中有两相，流动的水相和起固定相作用的胶束相，溶质在这两相间分配。 (2)电渗流向阴极移动，而电场中带负电的正相胶束则朝阳极迁移。叠加后胶束以低于电渗流的速度也向阴极移动。(3)对中性粒子，疏水性强的组分在胶束相中保留时间较长，迁移速度较慢；反之亲水性强的组分迁移速度较快。故中性粒子根据本身疏水性的不同而达到分离。5、MECC优点：分离效率高，速度快，因为：(1)电渗流的扁平流型，大大减小了径向的速度梯度。(2)毛细管柱的细管径有极高的散热效率。(3)胶束本身为动态结构，溶质进出方便迅速。三、毛细管筛分电泳：有两种。1、毛细管凝胶电泳：指在毛细管中进行的凝胶电泳。 凝胶有多孔性，起类似分子筛的作用。即流经凝胶的物质原则上按照分子的大小分离，服从筛分机理。* 特点：(1)柱效极高，但制备较难，寿命短。(2)进样端易堵，若有空泡则难以除去，影响分离。2、毛细管无胶筛分电泳：是用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联的聚丙烯酰胺凝胶。* 特点：(1)柱内不作交联反应，可避免形成空泡。(2)比凝胶柱便宜、简单，功能可调节。(3)柱子寿命长，制备容易，但分离能力稍差。3、不同类型的筛分电泳比较：四、毛细管电色谱： 是高效液相色谱和毛细管电泳相结合的分析分离方法。有填充柱电色谱，开管柱电色谱、薄层电色谱等。 * 特点：(1)采用电渗流推动流动相，克服了流速不均引起的峰扩展。(2)理论塔板数高。(3)具有高选择性，能分离带电物质，也能分离中性化合物。五、等电聚焦毛细管电泳、毛细管等速电泳： 是将等电聚焦电泳和等速电泳移到极细毛细管中进行的方法。* 特点：(1)自动化程度高。(2)易于改变操作模式或选择性，易于定性定量等。第四节 几种毛细管电泳仪简介一、1229型高效电泳仪 特点是简单实用。 (一)主要功能及性能指标1、进样方法：电迁移进样：进样电压030kV任意设定； 液体压差进样：进样高度50l00mm任选。2、冲洗方式：弹簧助推正压冲洗。3、高压电源：输出电压：030kV；电流0400mA；恒压精度0.1。4、在线检测器：为多波长紫外检测；检测灵敏度可调。5、数据处理：提供0l00mV信号电压输出，可供记录仪或积分仪处理数据。电器机箱内是高压电源。主机箱如图，包括毛细管柱、检测器、缓冲液槽以及附属装置。(二)仪器主要结构：1、检测器：为固定波长的紫外检测器，出厂时为254nm波长。若使用280nm等检测波长时，可更换汞灯前滤光片实现，如图。2、毛细管架：如图，与紫外检测器连接，毛细管从中间穿过，管子在检测窗口部位做烧蚀处理。 * 毛细管两端接线：如图，电极和毛细管端口都浸在缓冲液中；毛细管内充满缓冲液和样品溶液，盖上盖子。二、BioFocus-3000型毛细管电泳仪 特点是性能好，自动化程度高。(一)仪器的性能与指标1、进样方法：电迁移进样：进样电压030kV； 压力进样：高于大气压7倍的压力，适合大粘度样品。2、高压电源：电压030kV；电流0300mA。3、在线检测器：可编程序快速扫描检测，波长有紫外光和可见光连续可调；检测带宽为6.0nm，准确度为1.0nm，精密度0.1nm。4、数据处理：有4个模拟信号输出通道。5、自动控温：可自动准确控制温度在1540。6、范围选择：很广。7、工作环境：温度1040，湿度090。(二)仪器的主要结构：由三个部分组成。电泳系统：包括毛细管柱、高压电源、电极、离心管及其输送盘、升降器等；检测系统：包括光源、光栅、光二极管及信号检测电路。温控系统：包括毛细管柱冷却系统、盘室温控系统、光电二极管恒温控制系统。 毛细管室与盘室门都有保险装置，门一打开便立即断电。图为仪器局部剖视。1、检测器：为多波长快速扫描紫外可见检测器。(1)光学系统：光源光线经衍射光栅分光后成单色光，进入纤维分光器分成两束，分别射入参比和采样两光敏二极管，得参比和样品信号。因毛细管直径极小，故在柱检测点两侧加两个石英聚焦透镜。两个光敏二极管接收光束后，将转换的电信号输入放大器放大比较，可得正比于光强度的输出电压。(2)、检测方法： 作时间、吸收度及波长为坐标的三维吸收光谱图；根据图中各组分在相应波长的紫外吸收特征，可用于峰的确认，或鉴定组分中的杂质。(3)、检测方式：有三种供任意选择。单波长方式：运行中途可更换检测波长。多波长方式：一次运行用三个波长检测，同时可产生三张电泳图谱。高速扫描方式：在指定波长范围内可反复扫描，得到三维电泳图谱。光源由紫外光氘灯和可见光钨灯组合而成。2、电极：为铂金丝，质地柔软不易折断。毛细管入口处电极为高压，出口处为接地。3、毛细管柱：由石英制成。常用柱长2550cm，内径2550mm。不能用过高电压，否则会“漏电”，损坏管柱。4、输送盘与离心管：(1)输送盘：如图，有入口盘和出口盘，各按顺、逆时针旋转，并沿“轨道”推入拉出。每只盘有32个升降管，管口盖子可自动打开或盖严。(2)塑料离心管：装样品、入口缓冲液的离心管放入口盘。出口缓冲液、组分收集管等放出口盘。两盘不能互换。三、美国Agilent公司的 HP 3DCE 高效毛细管电泳仪【性能特点】是配有二极管阵列检测器(DAD)的全自动三维高效毛细管电泳系统。具有多种操作模式。包括毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动色谱(MEKC)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等电聚焦(CIEF)和毛细管等速电泳(CITP)，以及毛细管电色谱(CEC)等。可与电喷雾质谱仪联用，组成CEMS系统，进行毛细管电泳质谱分析。* 高灵敏度系统的专利设计 扩展光程毛细管，比标准毛细管检测灵敏度高35倍。高灵敏度池设计，比标准毛细管检测灵敏度高710倍；线性范围宽，01300mAU偏差仅1，02000mAU偏差3。二极管阵列检测器，其检测限、灵敏度和线性范围相当于或者超过了单波长或多波长检测器。 在光谱分析上，DAD比快速扫描检测器有显著优点，分析全过程都可有在线的光谱信息，可采集190600nm的紫外可见全光谱图，所有溶质在此范围内的吸收都可检测到，大大简化电泳数据的分析；DAD还可以检验出峰的纯度，其光谱分析和谱库检索功能有助于峰的定性分析。* 先进的系统重现性设计 缓冲液补充功能：对样品瓶自动在线更换和补充新缓冲液，可自动调节缓冲液液面高度，避免虹吸效应；500ml储备瓶可为长时间自动连续操作提供最大方便和优良的分析重现性。 毛细管卡套的高速风冷控温设计：用Peltier元件控温，控温范围广(460)，精度高(0.1)；10m/s的风速可避免焦耳热的产生，保证分析结果的重现性。完全密封的样品瓶设计：可阻止样品挥发，避免样品受热，并可通过循环水对样品盘进行控温，控温范围为1040。自校正压力进样系统，保证了样品的重现性和进样精度。* 系统的多功能设计 电色谱加压系统：可在阴极或阳极两段的样品瓶加高达12bar的外置压力(212bar可选)，避免在分析过程中电色谱柱产生气泡。独特的毛细管卡套设计：使毛细管的更换十分简便，并可使用国产自制的各种不同直径的毛细管进行分析，降低分析操作的运行费用。 自动进样和馏分收集设计：48位样品盘连续自动进样，可根据时间编程收集或按峰信号收集，完成馏分的自动收集过程。毛细管高压冲洗装置：可进行常压1bar冲洗或高压212 bar的冲洗，可在阴极或阳极两端的样品瓶分别设置可编程的冲洗压力方式。【技术指标】安全性能：漏电检测和仪器门或罩打开时，使高压无效。电泳电压范围：030KV；电流0300mA；功率06W；可在恒压、