荧光定量操作.doc

样品取回后，冻于-70冰箱中。样品包括组织样和血清样品。检查目的基因的表达情况。需要作的工作如下：1、 首先是组织总RNA的提取。提取步骤见TRNZOL试剂说明书。2、 组织mRNA提取后进行反转录，得到cDNA样品。3、 以CDNA样品为模板进行特定基因的扩增（可先用普通PCR验证/为了验证表达的差异，应采用定量PCR，并选用内参基因）注意：为了让提取的RNA 质量可靠，每次研磨的组织样品不能过多，这就要求我们在取样是不能取太多的样品，而且所取样品必须准确、可靠。否则会导致后续试验都不准确。一 总RNA 提取准备工作：、（一）基本器材和试剂1 实验器具与材料 （1） 移液枪：1ml、200ul、10ul （2） 枪头：1ml、200ul、20ul （3） 枪头盒：1ml一个,200ul和20ul的枪头盒至少一个 （4） EP管1.5ml、100ul （5） 研钵:据一次提取RNA样品多少定.（6） 容量瓶：1000ml （7） 盐水瓶：100ml （8） 广口瓶几个（配75乙醇，盛放氯仿，异丙醇等用） 2 实验器具的处理与准备 （1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于0.1%DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37过夜,然后送至高压锅灭菌(121-126 )至少30分钟，后在60-70烘烤箱中烘干，试验前将枪头放入枪盒。 优级耗材可直接使用。（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在0.1%DEPC水中泡8小时左右(过夜)，37烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤(100-200)3次。 （3） 金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水） 3 试剂配制和准备（1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。DEPC处理水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37过夜，送至高压去除未反应的DEPC。 （2） 75乙醇（最好在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇1:3),然后放于-4预冷备用。 （3） 异丙醇：放入棕色瓶 。（4） 氯仿：放入棕色瓶 。（5） Trizol：100ml/瓶 存放于4。 4. 抽提RNA工作台面准备1.在仅用于RNA抽提的超净工作台抽提RNA2. 工作台面用用RNAase失活剂处理。（二）总RNA提取步骤：1. 采样样品采集需均一，迅速，组织样品避免血液污染，样品采集后迅速置于液氮或是-70.2.样品的研磨:先用少许液氮将研钵冷却,然后取少许组织样放于盛有液氮的研钵内迅速研磨成细粉末，取约少100mg样品于预先加入1mlTrnzol 的EP管中,用力颠倒混匀，室温静置5分钟,充分裂解细胞。 3.加入氯仿向每管中加0.2ml氯仿。盖紧管盖，用漩涡振荡仪振荡15s（也可用手用力振荡1分钟左右），使其充分混匀，静置2-5min。 4.离心分离 4 下12000g离心15分钟, 样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA 主要在水相中，把水相（约500 l）转移到新管中，注意不要吸取到蛋白层。5. 转移上清 将含有RNA的上层清液转移到新的1.5mlEP管中后（约500ul),再加入0.5ml异丙醇,轻轻混匀后静置10分钟6RNA沉淀然后4 12000g离心10分钟,弃上清。离心前RNA 沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成白色胶状沉淀。 7.RNA洗涤加入1ml 75%乙醇(4摄氏度预冷)，轻轻洗涤沉淀,4，7500g5min，弃上清。注意在倒出液体时不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。此步可重复.8. 晾干室温放置晾干（不要晾的过干，RNA 过分干燥后会很难溶解，大约晾干23分钟左右，见乳白色沉淀变成透明胶冻状即可）9.溶解根据实验需要及得到RNA量的多少，加入30-100 l 无RNase 水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。为了保证RNA的浓度在可用范围，可使用20-30l水溶解。若浓度过大可再稀释。预防RNase 污染，应注意以下几方面：1 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。2 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。3 RNA 在TRNzol 试剂中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。4 配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，放置过夜，高压灭菌）。TRnzol法抽提总RNA流程图液氮研磨组织并取样约100mg ,加入预先盛有1mlTRnzol的EP管中振荡混匀后，室温5分钟加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）旋涡仪振荡混匀15S，（用手使劲摇动1分钟替代）室温静置2-5分钟4，离心12000g，15分钟转上层水相（约400-500l）于另一新1.5mlEP管中加等体积异丙醇（约400 -500l），混匀后室温10分钟4，离心12000g，10分钟弃上层清液后，加4度预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml4离心7500g，5分钟弃上清，可短暂离心后，用枪吸取多余的液体，空气干燥约30分钟（不能完全干燥）溶于DEPC处理水中至30l（20l-30l）（可在55-60水中，10分钟助溶）融解RNA立即保存于-70超低温冰箱中，或立即用于逆转录注意:1.样品量和Trizol的加入量一定要按组织100mg ,1mlTRIzol的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解2.实验过程必须严格防止RNsae的污染。二RNA质量和浓度检测分别采用1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白检测仪检测所抽提的总RNA的质量和浓度。1 琼脂糖凝胶电泳检测抽提的RNA的质量： 取10TBE缓冲液20ml加水至180ml，配成1TBE缓冲液； 称取1.0g琼脂糖置于200ml锥形瓶，加入100ml1TBE缓冲液，加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀； 待琼脂糖胶液冷却至5060（手感容器能耐受）时，加入5l Goldview，摇匀； 倒胶：迅速放好梳子后将凝胶缓缓倒入制胶膜中。凝胶的厚度在35mm之间。避免产生气泡，尤其梳子周围不能有气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。凝胶通常需要在室温中放置3045min。凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1mm小心移去梳子和隔离板，保持点样孔完整； 加样：用移液枪将RNA液和6载样液在无RNA酶的离心管中混匀，点样于样品孔中，并同样加DNA Marker于点样孔； 电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源，观察正负两极是否有气泡出现，如负极气泡比正极多，则证明电泳槽已经接通电源。100V电泳0.5h，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳； 观察和照相：在波长为254nm的长波长紫外灯下，观察是否出现两条完整的条带：28S和18S，分别为4800bp和1900bp，如果完整，则说明RNA质量可靠，并在凝胶成像系统下照相保存图片。2 核酸蛋白检测仪检测RNA的浓度：取5l总RNA和45l1TE于比色杯，用枪头混匀，在RNA程序下测样品相应数值，即：样品号，260nm吸光度，280nm吸光度，320nm吸光度，260/208nm吸光度比值，样品稀释倍数，样品中RNA的含量（g/ml，ng/l）。3. DNase处理 用无RNase的DNase处理，消除总RNA中痕量DNA的污染，操作步骤如下： 在微量离心管中配制下列反应液，总量50l；总RNA30g10DNaseBuffer 5lDNase（RNase-Free,5U/l） 2lRNase inhibitor （40U/l）0.5lDEPC H2O12.5l 37反应2030分钟； 加入50l的DEPC H2O； 加入100l（等量）的苯酚/氯仿/异丙醇（25:24:1），充分混匀； 13，200rmp离心5min，取上层（水层）移至另一微量离心管中； 加入100l（等量）的氯仿/异丙醇（24:1），充分混匀； 13，200rmp离心5min，取上层（水层）移至另一微量离心管中； 加入10l（1/10量）的3M醋酸钠（PH5.2）； 加入250l（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20放置3060分钟，以沉淀RNA； 13，200rmp离心15min，弃上清； 缓慢加入75%乙醇200l，13，200rmp离心5min以清洗沉淀，弃上清。重复清洗一次，弃上清，用离心机短暂离心10s，用Tip头吸干残留乙醇； 空气干燥10min（注意：切勿过分干燥，否则RNA将会很难溶解且A260/280会小于1.6），加30l DEPC H2O溶解10min，样品保存于-80三反转录（一）准备工作 1 实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）EP管1.5ml、200ul 2，实验器具的处理与准备 塑料制品：（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于1DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37过夜，然后送至高压至少30分钟，后在60-70烘烤箱中烘干（或置于37中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。 优级耗材可直接使用.3，试剂配制和准备： （1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制： 1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时 后备用。 逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37过夜，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20中保存备用。 （2）RT中所需要的各种试剂 1,RT试剂盒. 2,DEPC处理水或生化专用的RNase-free水. 3,10uM浓度的引物.（二）RT步骤 用RT试剂盒进行转录（10ul体积）。1， 准备200u的EP管 2， 冰上操作：按试剂盒说明书进行反应体系的配制.3， 配制好后,轻轻振荡以混匀样品,用小离心机将所有样品都离至管底。 4， 按说明书上的反转录条件在普通PCR仪上进行反转录.5， 反转录完成后,其管内产物即为PCR的模板.以10UL的反应体系来说,每次反应所需的模板量仅为1UL.6， 分装处理并做好标记,为了保证模板的完整性,应对反转录后的模板进行分装.分装后-20保存,PCR进再单管取样,减少模板冻融次数。 1.按下列组分配制RT反应液（在冰上进行，总体系10l）5Prime scriptTM Buffer 2lPrime scriptTM RT Enzyme Mix 0.5lOligo dT Primer（50M） 0.5lRandom 6mers（100M）0.5lTotal RNA 4lRNase Free dH2O 2.5l2.轻轻混匀后7500rmp离心35sec；3.在下列条件下进行反转录反应：37，15min，（反转录反应）；85，5sec（反转录酶的失活）；4.反转录产品-20保存待用。四普通PCR（一）引物的稀释在引物合成回来后，立即存放于20冰箱内。由于引物合成的量很少，稀释前先用离心机高速离心（10,000rpm，1min ），将DNA制品的粉末都离心至管底，然后加上引物nmol*10体积的无菌水，轻轻上下振荡5-10分钟，再次离心10,000rpm，1min，制成100uM的保存液，再取少许别稀释成10&20uM工作液，原液或工作液20保存。这样即可以减少引物被污染的机会，又可以减少因多次冻融而使引物降解或断裂，进而影响实验结果。在溶解DNA制品是，我们是先将其制备成100uM的保存液，然后再稀释成实验浓度。配制100uM的保存液的方法。灭菌水的使用量：体积（ul）nmol数*10.1umol=1000nmol=1000000pmol1uM=1umol/L=1nmol/ml=1pmol/ul（二）PCR准备1、实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）枪头盒：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）EP管1.5ml、200ul 2，实验器具的处理与准备 塑料制品：（包括吸头、EP管等）送至高压30分钟次，试验前将枪头放入吸头台。 3, 试剂配制和准备： (1)超纯水： 100ml盐水瓶内装40ml超纯水，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20中保存备用。 (2) PCR中所需要的各种试剂: Master-mix ， cDNA模板，rimer，无ase水（三）PCR步骤1， 准备200ul EP管2， 确定各成分的添加量(参照试剂盒说明).3， 在冰上操作,并放置在设定程序的PCR仪4， 再电泳检测结果5， 1.取0.2mlPCR管，依次加入下列试剂（PCR总反应体系为10l）：第一链cDNA 1l上游引物（10M） 0.5l下游引物（10M）