药物分析双面打印.pdf

药圈会员整理经典资料药物分析重点内容打印版 药圈 药学人员的圈子 第 1 页 共 13 页 第一章药典 第一节国家药品标准 国家药品标准的定义 国家对药品强制执行的质量标准 是国家制定的关于药品的规格 检验方法及生产工艺的技术要求 是药品生产 经营 使用 检验和监督管理部门共同遵循的法定依据 一 国家药品标准的组成与效力 国家药品标准的组成 由国家食品药品监督管理局颁布的 中华人民共和国 药典 药品标准 和药品注册标准 国家药品标准由国家药典委员会负责制订和修订 药品管理法 规定 药品必须符合国家药品标准 生产 销售 使用不符 合国家药品标准的药品是违法行为 二 国家药品标准的制订原则 1 检验项目的制订要有针对性注意各个环节的影响 2 检验方法的选择要有科学性准确 灵敏 简便 快速 3 限度规定要有合理性 第二节 中华人民共和国药典 名称 中华人民共和国药典 简称 中国药典 英文名为Pharmacopoeia of The People s Republic of China 简称为Chinese Pharmacopoeia 英文 缩写为Ch P 现行版 中国药典 2010年版 Ch P2010 由国家药典委员会编制和修订 由国家食品药品监督管理局颁布实施 一 中国药典 的沿革 建国之后至今共出版了 9 版 建国之后至今共出版了 9 版 建国之后共出了九版药典 1953 1963 分一 二部 1977 1985 有英文 版出现 1990 药品红外光谱集另行出版 1995 取消 拉丁文 二部外文 名称考为英文 2000 2005 分为三部 三部收载生物制品 首次将 中国 生物制品规程 列入药典 2010 二 中国药典 的基本结构与主要内容 中国药典 由一部 二部 三部及其增补本组成 内容分别包括凡例 正 文和附录 1 凡例 1 总则 凡例 规定了 中国药典 的名称 组成及内容和凡例的性 质 5 项目与要求药圈会员整理资料 1 规格 即制剂的规格 单位制剂中含有主药的重量或含量 或装 量 2 贮藏 贮存与保管的基本要求 所用术语有 避光 用不透光的容器包装 如棕色容器或黑纸包裹 密闭 密封 熔封或严封 阴凉处 不超过 20 凉暗处 避光并不超过20 冷处 2 10 常温 10 30 6 检验方法和限度 检验方法 均应按药典规定方法进行检验 若用其他方法 应与规定方法作 比较 以 中国药典 规定方法为准仲裁 原料药的含量百分数 均按重量计 如规定上限为100 以上时 指用药典规 定的分析方法测定时可能达到的数值 是药典规定的限度或允许偏差 并非 真实含量 上限如未规定时 指不超过101 0 7 标准品 对照品 标准品指用于生物检定 抗生素或生化药品中效价测定的标准物质 按效价 单位计 以国际标准品标定 对照品 均按干燥品 或无水物 计算后使用的化学物 8 计量计量仪器均应符合国物院质量技术监督部门的规定 计量单位p320表 长度mdmcmmmumnm 体积Lmlul 质量Kggmgugng 压力MPakPaPa 动力黏度Pa s 运动黏度mm 2 s 波数cm 1 密度kg m 3 g cm 3 放射性活度GBqMBqKBqBq 9 精确度 凡例 规定了取样量的准确度和试验精密度 1 称重 或 量取 的量 可根据数值的有效数位确定精确度 如 称取0 1g 指称取重量可为0 06 0 14g 称取2g 1 5 2 5g 称取2 0g 1 95 2 05g 称取2 00g 1 995 2 005g 2 精密称定 称取重量应准确至所取重量的千分之一 称定 称取重量应准确至所取重量的百分之一 3 精密量取 量取体积的准确度符合国家标准中对该体积移液管的精密度 要求 4 取用量为 约 若干 指取用量不得超过规定量的 10 5 恒重 指供试品经连续两次干燥或炽灼后重量差异在0 3mg 以下的重量 第 二次及以后各次需干燥 1h 或炽灼30min后 6 按干燥品计算 取未经干燥的供试品进行试验 另取样品同时进行 干燥失重 测定 再在计算时从取用量中扣除 7 空白试验 不加供试品或以等量溶剂替代供试液 按同法操作所得的结果 并将滴定的结果用空白试验校正 计算含量时V V样 V空 或V V空 V 样 试验时温度 未注明者 系指室温 温度高低影响显著者 除另有规定外 应以25 2 为准 10 试药 试液 指示液 试药 不同等级并符合国家标准或国家有关行政主管部门规定标准的化学试剂 药圈会员整理资料 试验用水均指纯化水 离子交换水 重蒸水 酸碱度检查所用的水均指新沸并放 冷至室温的水 2 正文收载药品的质量标准 正文内容主要包括 品名 有机药物的结构式 分子式和分子量 来源或有机药 物的化学名称 含量或效价的规定 处方 制法 性状 鉴别 检查 含量或效价 测定 类别 规格 贮藏及制剂等 1 名称 药品的名称包括中文名称按照 中国药品通用名称 命名 简称 CADN Chinese Approved Drug Name 中文名称的汉语拼音和英文名称 采用 国际非 专利药名 简称 INN International Nonproprietary Names 药品名称应明确 科学 简短 避免给患者暗示的有关药理学 解剖学 生理学 病理学 治疗学的药品名称 不得使用代号 2 有机药物的结构式 3 分子式和分子量 4 来源或有机药物的化学名称 5 含量或效价的规定 即含量限度 对于原料药 用有效物质的重量百分数 表示含量限度 效价测定 的抗生素或生化药品用效价单位 国际单位IU 表示含量限度 对于制剂 用含量占标示量的百分率表示 6 性状 性状项下主要记叙药物的外观 臭 味 溶解度以及物理常数 等 溶解度术语 极易溶解 指溶质1g ml 能在溶剂不到1 ml中溶解 几乎不溶或不溶 指溶质1g ml 在溶剂10000 ml中不能完全溶解 7 鉴别 指用规定的试验方法来辨识药品与名称的一致性 即辨识 已知 药品真伪 8 检查 该项下收载反映药品安全性与有效性的试验方法和限度 均一性与纯 度等制备工艺要求等内容 安全性 无菌 热原 细菌内毒素 等 有效性 与药物的疗效有关 在其它测定项目中不能有效控制的项目 1 难溶性药物须检查 粒度 2 抗酸药物须检查 制酸力 3 含氟药物须检查 含氟量 含乙炔基药物要检查 乙炔基 含氮量 VB1 的总氯量 硫酸庆大霉素中SO4 2 的检查 均一性检查 检查制剂的均匀程度 重量差异 检查 含量均匀度 检查 等 纯度检查是检查项下的主要内容 即药物杂质检查 9 含量测定 指用规定的方法测定药物中有效成分的含量 10 类别 11 贮藏 3 附录 中国药典 附录主要收载 制剂通则 通用检测方法和指导原则 通用检测方法包括 一般鉴别试验 分光光度法 色谱法 物理常数测定法 特殊 物质和基团测定法 一般杂质检查法以及制剂常规检查方法等 药典正文中使用的试药 试液 滴定液等也应按照附录的要求配制 4 索引中文索引和英文索引便于快速查阅 第三节第三节主要的外国药典 表1各国药典比较 由 欧洲药典 转载而来的品种标记 在品名后用斜体注明 起始和结尾还用 下 划线 和 Ph Eur 注明 第二章药物分析基础 药 典 英国药 典 美国药 典 美国国家 处方集 日本药 局方 欧洲药 典 全 称 及 缩 写 British Pharmacop oeia 缩写 BP 如 BP 2010 The United States Pharmaco poeia 缩写USP National Formulatio n 缩写 NF 如 USP 34 NF29 简称JP 第15改正 本 即 JP 15 European pharmacop oeia 缩写 Ph Eur 或 E P 制 订 出 版 单 位 英国药典 委员会 美国药典 委员会 美国药典委 员会 由日本药 局方编集 委员会编 篡 欧洲药品 质量委员 会 EDQM 与 Ch P 的 不 同 化学文摘 CA 登录 号 作用与 用途 可能 杂质结构 化学文摘 CA 登 录号 参 比物质要 求 化学文摘 CA 登录 号 容器 有效期 化学文摘 CA 登录 号 可能的 杂质结构 第一节药品检验工作的相关基础 一 药品检验工作的基本程序药圈会员整理资料 1 取样 指从一批产品中 按取样规则抽取一定数量具有代表性 的样品 供 检验用 一般等量取样 1 样品总件数n 3时 每件取样 2 样品总件数3300 时 按1 2 n 取样量随机取样 2 检验性状 鉴别 检查 含量测定 判断药品是否符合要求 综合检品的性状 物理常数 鉴别 检查与含量测 定的结果全面考虑 3 记录和报告真实 完整 简明 具体 供试品情况 检验情况 签名盖章 检验记录 检验人 复核人 检验报告上必须有检验者 复核者和部门负责人的签章及检验机构公章 二 中国药品检验标准操作规范 由中国药品生物制品检定所和中国药品检验总所编写 中国药品检验标准操作规范 从2005年版开始分为两卷出版 中国药品检验标准操作规范 收载的标准操作规范的主要内容包括 简述 仪器与用具 试药与试剂 操作方法 注意事项 记录与计算 结果判断 实例 重量差异检查法 药圈会员整理资料 简述 凡规定检查含量均匀度的片剂 一般不再进行重量差异检查 仪器与用具分析天平 扁形称量瓶 弯头或平头手术镊 记录与计算重量差异限度 0 30g 7 5 0 30g 5 0 三 常用分析仪器的使用和校正 1 分析天平 用于含量测定中供试品 对照品的称量和滴定液的标定等 一般分析天平有感量为 0 1mg 0 01mg 0 001mg 三种 当取样量大于 100mg 时 选 当取样量 10 100mg 时 选 当取样量小于 10mg 时 选用 2 分析仪器 1 旋光计用标准石英旋光管校正 2 pH 计用标准缓冲液校正 3 紫外 可见分光光度计 1 波长汞灯或氘灯的特征谱线为参照或钬玻璃的特定波长校正 2 吸光度的准确度用重铬酸钾的硫酸溶液检定 3 杂散光的检查可用 1 00g ml 的碘化钠或 5 00g ml 的亚硝酸钠溶液检 查 4 红外分光光度计 1 波数的准确性校正方法中所用测试样品为聚苯乙烯薄膜 绘制其红 外光谱图 2 分辨率用聚苯乙烯薄膜的红外光谱图进行检查 2 玻璃量器 实验室常用的玻璃量器有移液管 容量瓶 滴定管 量筒和 量杯等 容量瓶允许误差约为容积的千分之一 容量瓶校正所需的仪器有分析天平和 温度计 移液管和滴定管校正所需的仪器有分析天平 温度计 具塞锥形瓶 第二节药物分析数据的处理 一 误差 误差的定义 测量值对真实值的偏离 反映测定结果的准确度 误差越小 准确性越高 按计算方法分为绝对误差和相对误差 按来源不同分为系统误差和偶然误差 1 绝对误差和相对误差 1 绝对误差 测量值与真实值之差 可正可负 有单位 x 2 相对误差 为绝对误差与真实值的比值 无单位 相对误差反映误差在测量值中所占的比例 2 系统误差和偶然误差 1 系统误差 即可定误差 由某种确定的原因引起的误差 一般有固定的 大小和方向 正或负 重复测定时重复出现 根据来源可分为以下四种 1 方法误差用法定方法来校正 2 试剂误差由试剂不符合要求带来的误差 如试剂不纯等 通过更换试剂或作空白试验测知并加以校正 3 仪器误差校正仪器或求出校正值进行校正 4 操作误差由分析者操作不符合要求造成的 2 偶然误差 即不可定误差或随机误差 由偶然原因引起的 偶然误差服 从正态分布规律 绝对值大的误差出现概率小 绝对值小的误差出现概率大 正负偶然误差出现概率相同 可 通过增加平行测定的次数来减小偶然误差 二 有效数字 1 有效数字分析工作中实际能够测量到的数字 1 9均为有效数字 0 在非零数字前面是定位用的无效数字 其余位置都是有效数 字 用幂或 表示时 有效位数不能变 2 有效数字的修约规则 药圈会员整理资料 1 四舍六入五成双 5 后无数时 2 0149 2 01 5 2386 5 244 105 4 10 1 755 1 76 即若5后还有数 不论多小 则五均要进位 3 125001 3 13 2 不能分次连续修约 0 685349 0 6853 3 运算中可多保留一位 最后才修约至规定位数 4 修约标准偏差值或其他表示不确定度时 只要所需位数后面还有数字 不论 大小都进位 S 0 213 S 0 22 S 0 3 3 有效数字运算法则 1 加减法误差为各数字绝对误差传递的多少 可按小数点后位数最少的那个数 保留 再加减 例 0 5362 0 0014 0 25 0 79 2 乘除法误差为各数值相对误差传递的结果 可按有效数字位数最少的那个数 保留 再乘除 例 0 12 9 678234 0 12 9 68 第三节 药品质量标准分析方法的验证 中国药典 从2000年版起收载了 药品质量标准分析方法验证指导原则 验证的目的是证明采用的方法适合检验要求 验证的分析项目有 鉴别试验 杂质定量或限度检查 原料或制剂中有效成分的含 量测定 制剂中其他成分的测定以及溶出量的测定 溶出度 释放度 等 一 分析方法验证的内容有 准确度 精密度 专属性 检测限 定量限 线性 范围和耐用性 1 准确度 定义 该法测定结果与真实值或参考值接近的程度 一般用回收率 来表示 100 对 对 加入量 测得量 回收率 1 100 对 样总 加入量 含量测得量 加样回收率 2 2 精密度 1 定义 同一个均匀样品 经多次取样测定所得结果之间的接近程度 一般用 偏差 标准偏差 SD 或相对标准偏差 RSD 来表示 1 1 2 n xx SD n i i 3 100 x SD RSD 4 2 RSD越小 测定结果越集中 精密度越好 精密度好是准确度高的前提 但方 法的精密度好 准确度不一定高 只有在消除了系统误差的前提下 精密度好 准确度也高 3 精密度三种表示方法 重复性在相同条件下 由同一个分析人员测定所得结果的精密度 同人 仪 器 时间 可设计3个不同浓度 每个浓度分别制备3份供试液测定 或制备100 浓度水平的供 试品溶液6份 用至少测定6次的结果进行评价 中间精密度同室 但不同时间 不同人员 不同仪器设备测得结果的精密度 考察随机变动因素对精密度影响 药圈会员整理资料 重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度 例 下述验证内容属于精密度的有 A 定量限 B 重复性 C 重现性 D 专属性 E 中间精密度 3 专属性 在其他组分 杂质 降解产物 辅料等 可能存在的情况下 分析方法准确地测 出待测组分的特性 4 检测限 定义 在规定实验条件下所能检出被测组分的最低浓度或最低量 1 目视法非仪器分析法 2 信噪比法 为仪器分析法 把低浓度样品信号与空白样品信号比较 按信噪 比3 1或2 1时 的相应浓度或注入仪器的量确定检测限 5 定量限 样品中被测组分能被定量测定的最低浓度或最低量 其测定结果应具有 一定的准确度和精密度 一般以信噪比10 1时的相应浓度或注入仪器的量确定定量限 6 线性 在设计的范围内 测试结果和样品中被测组分的浓度 或量 直接呈正比 药圈会员整理经典资料药物分析重点内容打印版 药圈 药学人员的圈子 第 3 页 共 13 页 关系的程度 药圈会员整理资料 7 范围 在达到一定精密度 准确度和线性的条件下 分析方法适用的高低 限浓度或量的区间 适宜检测范围 原料和制剂含量测定范围为测试浓度的80 120 含量均匀度检查70 130 溶出量的测定限度的 20 同时含量测定和杂质检查时 范围为杂质限度的 20 至含量限度的 20 8 耐用性 指在测定条件有小的变动时 测定结果不受其影响的承受程度 不同检验项目对效能指标的要求 1 鉴别需检查专属性 检测限和耐用性 2 杂质检查 专属性 1 限量仅需检测限 耐用性 2 定量仅不需检测限 检测限 3 含量与溶出度测定 仅不需 定量限 所有检验项目均需检查专属性和耐用性 二 验证示例 1 鉴别化学鉴别法 验证专属性 检测限和耐用性 IR 法 验证方法的专属性 2 检查 1 溶液的澄清度杂质限量检查 2 游离水杨酸HPLC 法属杂质定量测定 需验证专属性 准确度与 精密度 定量限 线性与范围 耐用性 仅不需验证检测限 3 溶出度阿司匹林片溶出度测定用 HPLC 法 验证专属性 准确度与精 密度 线性与范围 耐用性 仅不需验证检测限和定量限 溶出度限度为标示量的 80 3 含量测定 1 酸碱滴定法阿司匹林原料药采用酸碱滴定法测定含量 方法学验证内 容包括准确度与精密度 耐用性 2 HPLC 法阿司匹林片采用 HPLC 法测定含量 方法学验证内容包括专属 性 准确度与精密度 线性与范围 耐用性 仅不需验证检测限和定量限 第三章物理常数测定法 物理常数的意义 是药物固有的物理特性 其测定结果对药品有鉴别意义 反映药品的纯度 物理常数收载在药品质量标准的 性状 项下 物理常数包括 熔点 相对密度 比旋度 折光率 黏度 吸收系数 凝 点 馏程 碘值 皂化值和酸值 第一节 熔点测定法 测定熔点的意义 鉴别药物 反映药物的纯杂程度 一 基本概念药圈会员整理资料 1 熔点m p 定义 按照规定的方法测定 物质由固体熔化成液体的温度 熔融同时分解 的温度或在熔化时自初熔至全熔的一段温度 二 测定方法 1 熔点测定方法 Ch P 共收载三法 图 6熔点测定法 2 仪器用具 容器 b 形管 搅拌器 温度计 分浸型 0 5 刻度 须校正 熔点测 定用毛细管 0 9 1 1mm 加热器 传温液 10 10 肾上腺素 地西泮 氟康唑 磷酸可待因 磷酸可待因注射液 维生素B1 2 有机碱的氢卤酸盐 适用药物 盐酸氯丙嗪 盐酸麻黄碱 盐酸吗啡 需加入的特殊试剂 加入醋酸汞的冰醋酸溶液 卤化汞消除氢卤酸的干扰 非水碱量法进行有机碱的氢卤酸盐的含量测定时需用的试剂有 冰醋酸 结晶紫指示液 醋酸汞的冰醋酸溶液 高氯酸滴定液 3 有机碱的硫酸盐 只能滴定至HSO4 如硫酸阿托品 反应摩尔比为 1 1 硫酸奎宁 摩尔比为 1 3 4 有机碱的有机酸盐 5 有机酸碱金属盐 第三节氧化还原滴定法 表1碘量法 铈量法 亚硝酸钠法 滴 定 方 法 滴定条 件 指示剂所用滴定液 及其标定 滴定反应应用 碘 量 法 直 接 酸性 中性 弱碱性 淀粉 滴 定前加 I2自身指 示剂法 碘滴定液 0 05mol L 配制 加KI作 用 形成KI3 2 I2 还原性药物 2I 维生素C 二 巯丙醇 1 1 1 1 5 5 5 5 20 00 0 1000 19 98 0 100020 00 0 1000 19 98 0 100020 00 0 1000 19 98 0 100020 00 0 1000 19 98 0 1000 H 5 0 10 mol L H 5 0 10 mol L H 5 0 10 mol L H 5 0 10 mol L 20 00 19 9820 00 19 9820 00 19 9820 00 19 98 5 1 5 1 5 1 5 1 0 020 020 020 02 OH 0 1000 5 0 10 mol L OH 0 1000 5 0 10 mol L OH 0 1000 5 0 10 mol L OH 0 1000 5 0 10 mol L 40 0240 0240 0240 02 药圈会员整理经典资料药物分析重点内容打印版 药圈 药学人员的圈子 第 5 页 共 13 页 助溶 降低I2 的挥发性 稳 定 加HCl作用 去除碘酸盐 防I2自身氧化 还原 标定 基准物 As2O3 淀粉指示剂 间 接 淀粉 近 终点加 碘滴定液 0 05mol L 和硫代硫酸 钠滴定液 0 1mol L 基准物 K2Cr2O7 剩余 还原性药物 I2 定 过量 2I I 2 剩 余 置换 氧化性药 物 I I 2 I2 2Na2S2O3 Na2 S4O6 2NaI 复方对乙酰 氨基酚片中 咖啡因的含 量测定 咖啡因与碘 生成沉淀 I2 咖啡因 1 1 2 空白试验校 正 铈 量 法 酸性1 1邻 二氮菲指 示剂 Ch P 自身 指示剂 硫酸铈滴定 液 0 1mol L 基准物 三 氧化二砷 As2O3 标定 加一氯化碘 催化作用 加 快Ce 4 氧化亚 砷酸H3AsO3的 速度 不受淀粉 糖类等干扰 特适合 糖浆剂 片 剂等 硫酸亚铁 片 葡萄糖 酸亚铁及其 制剂 富马 酸亚铁及其 制剂等 硝 苯地平 亚 硝 酸 钠 滴 定 法 1 酸 的种类 HCl及 浓度 2 T 室温 滴定速 度 先 快后慢 防 HNO2逸 失 3 加 2g KBr 作用 加快重 氮化反 应速 度 1 Ch P 采用永停 滴定法 2 还有 电位法 内指示剂 法和外指 示剂法 亚硝酸钠滴 定液 0 1mol L 基准物 对 氨基苯磺酸 亚硝酸钠滴定 液与芳伯胺 重氮化反 应 所有芳伯氨基 药物与亚硝酸 钠的摩尔比均 为1 1 盐酸普鲁卡 因 磺胺甲 恶唑及其片 剂 磺胺嘧 啶及其片剂 第五章分光光度法 紫外光区 200 400 nm 可见光区 400 760 nm 第一节紫外 可见分光光度法 一 基本原理 不同结构的物质分子能级差不同 可产生不同紫外 可见吸收光谱 一定浓度范围内 一定条件下 被物质吸收的光量 吸光度A 与该物质溶液 的浓度 C 和液层厚度 或光路长度 L 成正比 药物定量测定的 依据 A lg I I0 lgT E C L 物质对光的选择性吸收波长以及相应的吸收系数E是该物质的物理常数 吸收系数E有两种表示方法 C单位为 mol L 时 E为摩尔吸收系数 用 表 示 药圈会员整理资料 当C用 g 100ml 为单位时 E为比吸收系数 用E 1 1cm表示 E 1 1cm的物理意义 吸光物质C为1 1g 100ml 液层厚度L为1cm时 在一定 条件下 波长 溶剂 温度一定 测得的吸光度A 二 紫外 可见分光光度计的基本结构 图1 可见分光光度计的基本结构 光源紫外 氘灯或氢灯 可见 钨灯或卤钨灯 吸收池紫外 石英 可见 玻璃 石英 三 测定方法 1 对溶剂的要求 2 空白对照校正消除溶剂和容器的吸收的影响 当 pH 值有影响时 应将供试品溶液与对照品溶液的 pH 值调成一致 3 测定波长的检查 吸收峰的波长应在该品种规定波长的 2nm以内 以最大吸收波长 max为测定波 长 药圈会员整理资料 否则 应考虑供试品的真伪 纯度及仪器波长的正确性 4 供试品溶液的浓度使吸光度在0 3 0 7间为宜 5 仪器狭缝宽度的选择调至供试品溶液的吸光度不再增大为准 四 应用 一 鉴别 中国药典 所采用方法 1 核对吸收光谱的特征参数 最大吸收波长 max 吸收系数E 1 1cm 吸光度 A 2 比较吸光度比值 3 比较吸收光谱的一致性 二 杂质检查 依据 药物与杂质的结构不同 故吸收光谱也不同 如 地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 地蒽酚在432nm处无吸收 杂质二羟基蒽醌在该 波长处有最大吸收 规定吸光度的上下限可在一定程度上控制杂质的量 三 含量测定 1 对照品比较法 AR AX ECRL ECXL CR CX CX AX AR CR 1 对照品溶液的浓度应为供试品溶液浓度的100 10 所用溶剂及测定条件应完全 一致 2 吸收系数法 绝对法 A E 1 1cmCL C A E 1 1cmL 2 对仪器须进行严格的校正和检定 3 计算分光光度法如双波长分光光度法 导数光普法 主要用于消除样品中干扰组分的干扰 4 比色法 属于可见分光光度法 第二节 红外分光光度法 红外吸收光谱 吸收波数在4000 400cm 1范围的红外光而产生的吸收光谱 利用红 外吸收光谱对物质进行分析的方法称为红外分光光度法 Infrared Spectrometry 缩写IR 一 基本原理 一 红外吸收光谱的产生 红外吸收光谱是由分子的振动 转动能级跃迁引起的 又称为分子的振 转光谱 振动过程中 若分子偶极矩发生变化 则相应振动为红外活性振动 产生吸收峰 没有偶极矩变化的振动为红外非活性振动 不产生吸收峰 偶极矩变化越大 红外 吸收越强 如C O 强吸收峰 红外吸收光谱纵坐标 透光率 T 横坐标 波数 cm 1 或波长 m m 二 红外光谱与物质结构的关系 1 官能团区与指纹区 官能团区 4000cm 1 1300cm 1 指纹区1300cm 1 400cm 1 1900 1650 cm 1 羰基峰 C O 很少与其它峰重叠 谱带强度很大 最易识 别的吸收峰 最受重视 2 典型化学键的红外特征吸收峰 P362页表5 1典型化学键的红外特征吸收峰表 3750 3000 cm 1 羟基O H 氢氧伸缩振动 2400 2100 cm 1 氰基C N 炔基C C 1900 1650 cm 1 强吸收的基团 羰基C O 由羰基C O伸缩振a动所引起 1670 1500 cm 1 苯环的骨架振动 p362 页 倒数第二段例子 二 红外分光光度计的基本结构 目前常用的红外分光光度计为傅里叶变换型红外分光光度计 傅里叶变换型用迈克尔逊干涉仪 图2傅里叶变换型 三 测定法与注意事项 一 测定法 非挥发性液体样品可采用纯液体或适宜溶剂稀释成溶液 置于两块盐片之间 常用 盐片有 KBr KCl 和 NaCl 常用的溶剂是 CHCl3和 CS2 固体样品常用压片法进行测定 偶尔也使用糊法或沉积为透明薄膜的方法进行测 定 二 供试品测定与注意事项 药圈会员整理资料 对仪器用聚苯乙烯薄膜进行校正 以确保测定波数的准确性和仪器的分辨率符合要 求 1 原料药鉴别 多晶现象 预处理后再绘制光谱 比对 或用对照品在相同 的条件下同时进行重结晶 再绘制光谱 比对 2 制剂鉴别 常用溶剂提取法 若制剂辅料无干扰 但待测成分的晶型有变 化 此种情况可用对照品经同法处理后的光谱比对 3 多组分原料药鉴别不能用全光谱比对 而是以各组分原料药的标准光谱 为参照 4 晶型 异构体限度检查或含量测定按规定操作 四 应用 一 鉴别依据 特殊性强 方法 按 药品红外光谱集 中收载的制备方法制备 再与标准图谱比较 应一致 二 检查依据 药物及其同质异晶杂质在特定波数处的吸收有显著差异 主要用于检查的项目为 无效或低效晶型 如甲苯咪唑 A 晶型为低效晶型 C 晶型为有效晶型 第六章色谱法 色谱法 是分析混合物的最有效的手段 应用范围 定性鉴别 纯度检查 含量测定 第一节色谱法基础 一 常用术语 1 色谱图和色谱峰 色谱峰 正常 正态分布曲线 不正常 拖尾峰和前延峰 用拖尾因子衡量 每个组分的色谱峰可用三项参数说明 峰高或峰面积 用于定量 峰宽W 用于衡量柱效 峰位 用保留值tR表示 用于定性 2 基线 色谱分离过程中 没有组分流出时的流出曲线 反映色谱系统 主要是 检测器 噪音水平 3 保留值 保留时间 tR 死时间 t0 调整保留时间 tR tR tR t0 相对保留值 r 即选择性因子 r2 1 tR2 tR1 k2 k1 4 色谱峰区域宽度 标准差 s 半高峰宽 Wh 2 峰宽 W 二 基本理论 1 分配系数与色谱分离 色谱过程是物质分子在相对运动的两相 固定相和流动相 间分配平衡的过 程 混合物中 若两组分的分配系数 K 和容量因子 k 不等 差 速迁移被分离 1 分配系数K 组分在固定相和流动相之间达到分配平衡时的浓度之比 K Cs Cm 3 K 与组分自身特性 固定相 流动相的性质及温度有关 色谱法分离依据 不同组分在固定相和流动相间K的差异分离 2 容量因子k 质量分配系数 达分配平衡后 组分在固定相和流动相 中的质量之比 k Ws Wm 4 k与K的关系 k Cs Vs Cm Vm K Vs Vm 5 k 与组分 固定相 流动相的性质及温度有关 还与两相体积有关 不同组分之间的k差异是色谱分离的先决条件 3 色谱过程方程 tR t0 1 K VS Vm t0 1 k 6 2 2 塔板理论塔板理论 色谱柱踏板数大于10 3时 流出曲线趋于正态分布 理论踏板高 H 可由柱长 L 和理论踏板数n计算 H L nn 5 54 tR Wh 2 2 7 式中分子分母单位统一 H和n都是柱效指标 可用于评价柱效高低 塔板数越多 塔板高度越小 柱效越高 3 速率理论速率理论药圈会员整理资料 Van Deemter方程 范氏方程 H A B u Cu A为涡流扩散项 B为纵向扩散系数 C为传质阻抗项 HPLC中范式方程简化为 H A Cu 8 影响液相色谱柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗 三 分类 中国药典 将色谱法分为纸色谱法 薄层色谱法 柱色谱法 气相色谱法 高效液相色谱法 电泳法 毛细管电泳法及分子排阻色谱法等 1 按分离原理分类 吸附色谱法 固定相为固体 吸附剂 分配色谱法 固定相为液体 离子交换色谱法 固定相为离子交换树脂 分子排阻色谱法 空间排组色谱法 凝胶色谱法 固定相为多孔性填料 凝 胶 第二节薄层色谱法thin layer chromatographyTLC 薄层色谱法 主要用于药品的鉴别或杂质检查 按分离原理主要分为 吸附 分配和分子排阻色谱法 吸附薄层色谱法最常 用 吸附薄层色谱法分离依据 难被吸附化合物移动快 产生差速迁移 KA KB 分离 一 仪器与材料药圈会员整理资料 吸附TLC法固定相为吸附剂 最常用硅胶 其次有硅藻土 氧化铝 微晶纤维素 聚酰胺等 硅胶 SiO2 xH2O 具有硅氧交联结构 表面有许多硅醇基的多孔性微粒 硅醇基 是活性基团 含水量 活性 活化 105 110 加热30 min 吸附力增强 TLC常用硅胶G 硅胶GF254 硅胶H和硅胶HF254 二 操作方法 1 薄层板的制备 涂布厚度0 2 0 3 mm 2 点样与展开 点样的样点一般为圆点 点样基线距底边 2 0cm 样点直径一般为 2 4mm 展开时 薄层板浸入展开剂的深度为距薄层底边 0 5 1 0cm 三 色谱系统适用性试验 目的 使斑点的检测灵敏度 比移值 Rf 和分离效能符合规定 1 检测灵敏度被测物质能被检出的最低量 2 比移值 Rf 基本定性参数 Rf l lo 9 Rf最佳范围0 3 0 5 可用范围0 2 0 8 3 分离效能分离度 R 表示 R 2d W1 W2 10 四 应用 TLC法主要用于药品的鉴别或杂质检查 一 鉴别 将同浓度的供试品溶液 对照品溶液点在同一薄层板上 展开显色后 供试 品 对照品颜色与比移值Rf均一致 可认为供试品与对照品是同一物质 1 与对照品比较Rf值 2 与结构相似的物质比较Rf值 二 杂质检查 1 杂质对照品法 杂质斑点颜色与杂质对照品斑点比较 不得更深 可认为未 超过规定的杂质最高限量 自身稀释对照法 高低浓度对比法 适用于得不到杂质对照品的情况 供试品溶液按限度规定稀释成另一低浓度溶液或系列溶液 为对照溶液 供试品杂 质斑点与相应的自身稀释对照液所显主斑点比较 颜色不得更深 图3拱试品 对照品 第三节高效液相色谱法 high performance liquid chromatographyHPLC HPLC法包括分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法和分子排阻色谱法 其中分 配色谱法最常用 高效液相分配色谱法又可分为正相分配色谱法和反相分配色谱法 正相分配色谱法 流动相极性 固定相极性 主要用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质 反相分配色谱法 流动相极性 固定相极性 主要用于分离非极性至中等极性物质 一 HPLC仪器的基本结构 高压输液泵 色谱柱 进样阀 六通进样阀 检测器和积分仪或色谱工作 站 二 检测器 药圈会员整理资料 一 选择性检测器 也称浓度型检测器 包括紫外检测器 光电二极管阵列检 测器DAD 荧光检测器 电化学检测器和质谱检测器 二 通用型检测器 也称质量型检测器 包括示差折光检测器和蒸发光散射检 测器 ELSD ELSD仅适用于 UV 检测困难的物质分析 如糖类和脂质等 以及药物杂质的确认 如ChP用HPLC ELSD法测定硫酸庆大霉素中C组分的含量 三 固定相与流动相 一 固定相 HPLC最常用的固定相是化学健合相 分为非极性键合相和极性键合相 1 非极性健合相 十八烷基硅烷健合硅胶 ODS C18 辛基硅烷健合硅胶 C8 ODS在反相HPLC中最为常用 2 极性健合相 常用氨基和氰基硅烷键合相 即可用于正相色谱法 也可用于 反相色谱法 多用于正相HPLC 二 流动相 药圈会员整理经典资料药物分析重点内容打印版 药圈 药学人员的圈子 第 7 页 共 13 页 药物分析中应用最多的HPLC法为反相分配色谱法 流动相首选甲醇 水系统 末端波长检测时首选乙腈 水系统 ODS为固定相时 流动相中有机溶剂比例通常应不低于5 流动相pH值应控 制在2 8间 分析强极性化合物常用离子抑制色谱法或离子对色谱法 分离碱类常用离子对试剂为烷基磺酸 盐 酸类常用烷基季铵盐如磷酸四 丁基铵等 四 色谱系统适用性试验 色谱系统适用性试验通常包括 理论踏板数 分离度 重复性和拖尾因子等 四个指标 在各品种项下规定的色谱条件下 固定相种类 流动相组成 检测器类型不 得改变 1 色谱柱的理论踏板数 n n用于评价色谱柱的分离效能应指明测 定物质 n 16 tR W 2 或n 5 54 tR Wh 2 2 11 tR Wh 2统一单位 如测得n低于规定 应改变柱长或载体性能 重填色谱柱等以求达到 2 分离度 R 评价待测组分与相邻共存物或难分离物质间的分离程度 衡量色谱系统效能 的关键指标 R 2 tR2 tR1 W1 W2 或R 2 tR2 tR1 1 70 W1 h 2 W2 h 2 12 R 1 5 3 重复性 外标法时 对照品溶液连续进样5次 其峰面积测量值的 RSD 2 0 内标法时 配制相当于80 100 和120 的对照品溶液 加规定量的内标溶 液 配成3种不同浓度的溶液 分别至少进样2次 计算平均校正因子 其RSD 2 0 4 拖尾因子 T T W0 05h 2d1T应在0 95 1 05之间 五 测定法 中国药典 用HPLC杂质检查方法有5种 1 内标法 测定对照品和内标物质的峰面积或峰高 计算 校正因子 f As Cs AR CR 13 含量 Cx f Ax AS CS 14 可避免样品前处理及进样体积误差对结果的影响 2 外标法 含量 Cx CR Ax AR 15 3 加校正因子的主成分自身对照法 需杂质对照品和待测成分对照品 测定时 对照溶液为供试品溶液的稀释溶液 4 不加校正因子的主成分自身对照法无对照品 对照溶液为供试品溶液的稀释溶液 稀释程度应为 浓度与杂质限度相当 5 面积归一化法 六 应用 一 鉴别供试液主峰的保留时间与对照液一致 二 杂质检查 中国药典 用HPLC杂质检查方法有5种 1 内标法 2 外标法 3 加校正因子的主成分自身对照法 4 不加校正因子的主成分自身对照法 5 面积归一化法 三 含量测定 内标法 外标法 药圈会员整理资料 对内标物质的要求 原供试品中不含有的组分 其保留时间与待测组分 相近 但能完全分开 纯度符合要求 第四节气相色谱法 气相色谱法 gas chromatography GC 系采用气体流动相流经装有填充剂 的色谱柱进行分离测定的色谱方法 不适于难挥发和热稳定性差的物质的分 析 一 仪器的基本结构 气相色谱仪由载气源 进样部分 色谱柱 柱温箱 检测器和数据处理 系统等组成 载气源可用氦 氮 氢作载气 常用载气为氮气 顶空进样 适宜于固体和液体样品中挥发性组分的分离和测定 二 检测器 气相色谱检测器可分为浓度型检测器和质量型检测器 浓度型检测器有热导 检测器 电子捕获检测器ECD 1 火焰离子化检测器 FID 氢气为燃气 空气为助燃气 检测器温度应高于柱温 并不低于150 防水气凝结 否则倒流 通常为 250 350 2 电子捕获检测器 ECD 主要用于含卤素药物 3 质谱检测器 MS 能给出相应的结构信息 4 热导检测器 TCD 检测组分的浓度变化 三 常用固定液与载体 基于分配机制分离的气液色谱法 GLC 最为常用 一 常用的固定液 药圈会员整理资料 烃类 常用的角鲨烷 鲨鱼烷 是标准非极性固定液 硅氧烷类 应用最广的通用型固定液 主要有甲基硅氧烷 SE 30 和苯 基硅氧烷 SE 52 OV 17 OV 25等 醇类 聚乙二醇 如PEG 20M 是药物分析最常用的固定液之一 二 载体 担体 作用 承载固定液 为化学惰性的多孔性微粒 常用硅藻土型载体 分为红色载体和白色载体 四 色谱系统适用性试验 在各品种项下规定色谱条件下 检测器种类 固定液品种及特殊指定的色谱材 料不得改变 试验内容及要求同HPLC 五 测定法 内标法 外标法 面积归一化法 标准溶液加入法 六 应用 一 鉴别供试液主峰的保留时间与对照品溶液一致 二 杂质检查 内标法 外标法 面积归一化法和标准溶液加入法 三 在含量测定中的应用 内标法 外标法和标准溶液加入法 第五节电泳法 电泳法 electrophoresis 是指带电荷的供试品在惰性支持介质中 在电场的作 用下 向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动 使组分分离成狭窄的区带 用 适宜的检测方法记录其电泳区带图谱并计算其含量 的方法 一 基本原理药圈会员整理资料 v E 16 双电层与电渗 电泳所用的支持物 如滤纸 在溶液中带负电 而使接近其表面 的缓冲液带正电 且形成双电层 在电场的作用下 带正电的缓冲液整体向负极移 动 形成电渗 电泳分离后各组分的相对位置由组分的电泳泳动和缓冲液的电渗共同决定的 二 平板电泳法 1 纸电泳法 2 醋酸纤维素薄膜电泳法 3 琼脂糖凝胶电泳法 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 5 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 三 毛细管电泳法 capillary electrophoresis CE 以弹性石英毛细管为分离通道 以高压直流电场为驱动力 依据样品中各组 分淌度和 或 分配行为上的差异而实现分离 毛细管电泳的主要分离模式 1 毛细管区带电泳 CZE 2 毛细管凝胶电泳 CGE 3 毛细管等速电泳 CITP 4 毛细管等电聚焦电泳 CIEF 5 胶束电动毛细管色谱 MEKC或MECC 6 毛细管电色谱 CEC 四 应用 1 鉴别 主成分与对照品迁移率一致 ChP用琼脂糖凝胶电泳法对肝素钠乳膏进 行鉴别 2 分子量测定 ChP用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法对注射用重组人促红素分子量进 行测定 3 纯度检查 4 等电点测定 5 分子组分比的测定 第七章 体内药物分析法 治疗药物监测 Therapeutic Drug Monitoring TDM 第一节 体内样品的种类 体内样品包括各种体液和组织 主要包括血液 尿液 唾液 最为常用的样本是 血液 体内样品的采集时间 根据临床治疗药物监测的不同目的确定 一 血样 血样包括全血 whole blood 血浆 plasma 和血清 serum 是最为常用的体 内样品 1 血样 全血 的采集 采集后置含有抗凝剂的试管中 常用的抗凝剂有肝素 EDTA 草酸盐 枸橼酸盐等 2 血浆的制备更为常用 将采集的全血置含有抗凝剂的试管中 离心 分取上清液即为血浆 3 血清的制备 将采集的全血在室温下放置至少 0 5 1 0h 待血液凝固后 再离心 分取上清液 即为血清 血样采集后应及时分离血浆或血清 并最好立即分析 否则 短期保存时可置冰箱 冷藏 4 长期保存需在 20 或 80 下冷冻贮藏 全血未经分离时不宜直接冷 冻保存 若待测药物在样本中易受酶或酸碱等的作用发生进一步变化 可选用的处置方法包 括低温冷冻 调节酸碱度 加酶抑制剂等 二 尿液 图 4尿液主要成分 尿液浓度测定主要用于药物尿液累积排泄量 尿清除率或生物利用度的研究 以及药物代谢物及其代谢途径 类型和速率等的研究 临床上亦可推断患者 是否违反医嘱用药 尿液样品的采集和测定应当与肾功能指标进行关联分析 测定尿液中药物浓度时应采用时间尿 测定尿液中药物的总量时 应收集用 药后一定时间内的全部尿液 进行分析 一 唾液 唾液是腮腺 颌下腺 舌下腺和口腔黏膜腺体分泌的黏液在口腔里混合而成 的消化液 唾液的采集方法 尽可能在安静状态下进行 一般在漱口后 15min 收集 1min 内大约可采集 1ml 采集后应立即测量其除去泡沫部分的体积 离心 分取上 清液 第一节体内样品处理 一 体内样品处理的目的 减少干扰 提高检测灵敏度和特异性 降低对仪 器的污染和损害 二 体内样品处理的常用方法 血浆或血清需除蛋白 尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出 唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白 体内样品处理常用方法有 去除蛋白质法 缀合物水解法 分离纯化与浓集 法 化学衍生化法 一 去除蛋白质法 去除蛋白质常用的方法包括蛋白沉淀法和蛋白分解法 1 蛋白沉淀法常用的方法包括 加入有机溶剂 强酸和无机盐 1 1 加入与水混溶的有机溶剂 水溶性的有机溶剂可使蛋白质分子内及分子间的氢键变化 使蛋白质凝聚 进而使与之结合的药物释放 常用的水溶性有机溶剂有 乙腈 甲醇 丙酮 四氢呋喃等 乙腈沉淀蛋白质为絮状 易于离心去除 甲醇沉淀蛋白则为细小颗粒状 需 高速离心去除 使用乙腈或甲醇时上清液 pH 为 8 5 9 5 使用丙酮时上清液 pH 为 9 10 2 加入强酸 当溶液 pH 低于蛋白质的等电点时 蛋白质以阳离子形式存在 可与酸根阴离 子形成不溶性盐而沉淀 常用的强酸有 10 三氯醋酸 7 高氯酸 5 偏磷酸 所得上清液呈强酸性 pH0 4 3 加入无机盐 加入无机盐后 溶液的离子强度发生变化 抑制蛋白质解离 使蛋白质盐析 脱水而沉淀 常用的中性盐有 饱和硫酸铵 硫酸钠 镁盐 磷酸钠及枸橼酸盐等 所得上清液近中性 pH 为 7 0 7 7 2 蛋白分解法 酶解法 枯草菌溶素酶解法主要用于肝脏组织中药物的测定 二 缀合物水解法 常用的缀合物水解法包括 酸水解 HCl 或磷酸溶液 和酶水解 葡糖醛酸苷 酶或硫酸酯酶 三 分离纯化与浓集法 萃取法应用最多 1 液 液萃取法 liquid liquid extraction LLE 乙醚或氯仿 常用有机溶剂有乙酸乙酯 甲基叔丁基醚 乙醚 三氯甲烷和正己烷 调节水相的 pH 值与待测药物的 pKa 值差异大于 3 个 pH 单位 中性药物大都 在 pH7 附近萃取 体内样品中内源性物质多数为酸性 所以在碱性条件下用有机溶剂萃取时 内源性干扰物质相对较少 强极性水溶性药物采用离子对萃取法 2 固相萃取法 solid phase extraction SPE 将具有吸附 分配或离子交换性质的大比表面积吸附填料作为萃取剂填成小 柱 柱色谱分离方法 采用柱切换技术直接进行在线 SPE on line SPE 纯化与富集 四 化学衍生化法 目的 1 改变待测药物的色谱行为 2 增强药物的稳定性 3 改善 手性拆分 分离能力 4 提高检测灵敏度 第三节体内样品测定 一 体内样品测定的常用方法 免疫分析法和色谱分析法 免疫分析法多用于临床治疗药物监测 色谱分析法多用于药代动力学研究 二 定量分析方法验证 体内样品定量分析方法验证的指标有特异性 标准曲线与线性范围 定量下 限 LLOQ 精密度与准确度 样品稳定性 提取回收率 质控样品 质控样品系将已知量的待测药物加入到