颜蕴文(乳腺癌患者外周血肿瘤细胞及相关基因检测研究进展).doc

大会交流乳腺癌患者外周血肿瘤细胞及相关基因检测研究进展颜蕴文 王本忠 张敬杰230022 安徽，安徽医科大学第一附属医院乳腺外科在发达国家中，乳腺癌居女性恶性肿瘤发病率的首位，死亡率的第二位。许多资料显示中国大城市随着社会发展，经济生活水平提高，自然环境破坏和生活节奏加快，生活压力增大，女性乳腺癌发病率明显增加。早期发现与合理综合治疗是治愈乳腺癌的关键。因乳腺癌是异质性疾病，可据肿瘤分级、肿瘤大小、淋巴结受侵情况、受体状况及有无远处转移等对肿瘤评价并行个体化治疗。但仍有许多患者，即使是淋巴结阴性的早期患者，也可复发与转移，提示须寻找预后因素。许多文献报道，乳腺癌患者外周血中的肿瘤细胞可作一独立预后因素，并与无复发生存有关。1 外周血肿瘤细胞临床发现，有些术前分期早，术后病理证实未见淋巴结转移的认为是较早期的乳腺癌患者，接受正规综合治疗后，短期内很快复发转移死亡；但有些术前原发肿块较大甚至是局部晚期的患者，在经新辅助治疗后手术及相关治疗，能长期生存。这一现象用已有的经验和理论很难解释，而外周血循环肿瘤细胞微转移学说对此提供了理论依据1。由于外周血标本易得，创伤小，可反复采集，是较理想的检测微转移标本。近年来免疫细胞化学，流式细胞术，Western blot及PCR技术的发展使检测乳腺癌患者外周血中肿瘤细胞成为可能。研究发现，随着肿瘤细胞的不断增殖，部分细胞失去相互附着能力，从肿瘤母体脱离，降解、浸润周围组织，进入血液或淋巴系统。转移的肿瘤细胞游出血管外，通过细胞外基质迁移到合适生长部位，被激活分裂、增殖形成转移灶。某些诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环，如外科手术，空芯针活检等，在实际临床工作中怎样检测外周血液中的肿瘤细胞，及这些指标的临床意义对患者预后的预测仍需大量资料证实。2 检测指标2.1 肿瘤标志物CA153,CEA,CA125近年来，肿瘤标志物检测已越来越多地用于临床诊断与治疗恶性肿瘤，国内外一些研究显示2，糖类抗原153(CA153)认为是诊断乳腺癌较灵敏的肿瘤标记物3，但单项检测CA153常有局限性，且CA153在乳腺癌早期敏感性较低，对早期诊断乳腺癌其敏感性和特异性均欠佳。CA125是卵巢癌和子宫内膜癌的特异性肿瘤标志物，在卵巢癌患者中有较高的检出率，在乳腺癌中也有较高表达4。CEA是一种广谱肿瘤标志物，由内胚层细胞分泌的一种糖蛋白，主要检测消化道癌，在其他肿瘤中也有一定表达。陆云飞等5测定CEA在乳腺癌中的诊断敏感性为19.9，说明CEA对乳腺癌的诊治、疗效和预后观察有一定意义，相关文献6统计发现CA153、CA125和CEA三项联合检测阳性率为86，可明显提高乳腺癌的诊断阳性，对肿瘤早期诊断有帮助。常用的检测方法是化学发光免疫分析法(chemiluminescent immunoassay,CLIA)。2.2 CK19及人乳腺珠蛋白（hMAM）的检测细胞角蛋白是上皮细胞骨架系统中间丝成分之一，表达于正常上皮及上皮源性原发肿瘤及其转移肿瘤细胞，CK19(cytokeratin19，CK19) 是其中一种组分，在各种腺上皮和腺上皮起源的恶性肿瘤中均有表达，在上皮性肿瘤组织中表达稳定7，但在正常外周血、骨髓组织、淋巴结中则不表达,其敏感性较高而特异性不足。因此，Watson等8发现了人乳腺珠蛋白(human mammaglobin，hMAM)，hMAM基因只在乳腺上皮细胞中表达且在乳腺癌中过度表达。由于其乳腺特异性的表达，hMAM mRNA和蛋白可能作为乳腺癌诊断标记。肿瘤微转移时脱落的癌细胞数量少，浓度低。以往的免疫组化、形态学等方法无法检测出血液、骨髓、淋巴结等处微转移。随着分子生物学技术的发展，实时荧光定量PCR，因敏感性高，运用实时荧光定量PCR技术联合检测CK19及hMAM的基因表达，常可作为判断游离肿瘤细胞存在，微转移及预后的一种较可行方法。乳腺癌患者外周血CK19与hMAM mRNA检出率与乳腺癌患者的淋巴结转移状况、TNM分期有明显相关性，而与患者年龄、激素受体状态及HER-2情况无明显相关，与Bernstein等9报道结果一致。一旦乳腺癌患者的外周血中检出CK19与hMAM mRNA的表达，则表明可能存在微转移，应予高度重视，也可进行相关检查佐证。因此，对乳腺癌患者外周血中CK19与hMAM mRNA进行长期动态监测有临床意义。2.3细胞周期蛋白E（Cyclin E）的检测Cyclin E是周期蛋白依赖激酶2的调节亚单位,促进细胞周期G1至S期移行过程,高水平Cylcin E加速细胞通过G1期，促进细胞分裂增殖。目前认为细胞周期的失控是造成癌细胞恶性增殖的主要原因之一，而Cyclin E作为调控细胞周期的关键蛋白，一旦其基因扩增或表达失控则可能诱发肿瘤。近年研究发现Cyclin E分为全长型和低分子量剪切型（LMW）。全长型Cyclin E在正常细胞和肿瘤细胞中均有表达,而LMW Cyclin E几乎只在肿瘤细胞和组织中表达。实验证实LMW Cyclin E比全长型Cyclin E在乳腺癌的发生发展过程中起着更重要的作用。Keyomarsi等10选取395例乳腺癌，平均随访6.4年后得出，Cyclin E和其他生物学指标(如ER、PR、HER-2、Cyclin D1 和Cyclin D3)相比，与肿瘤预后的相关性更大，且再次肯定LWM Cyclin E较全长型Cyclin E在判断乳腺癌预后方面扮演了更重要的角色。Han等11对175名接受CMF方案（CTX+MTX+5-Fu）化疗的无腋窝淋巴结转移的肿瘤标本进行检测，发现Cyclin E的表达同不良预后之间成正相关。Rudolph等12研究发现，Cyclin E似乎对绝经后乳腺癌患者病情预后判断更准确。充分肯定了Cyclin E在判断乳腺癌预后方面的价值。另Span等13发现ER或PR阴性患者的辅助内分泌治疗有效率不到10%，可能与肿瘤组织中Cyclin E呈高表达相关。Aklis等14认为LMW Cyclin E的过表达通过增加基因组不稳定性导致不良预后，再次证明LMW Cyclin E的过表达使ER/PR阳性患者的内分泌疗效降低。采用Western印迹方法可既有效地检测全长Cyclin E的表达，又能检测LWM Cyclin E的表达，对上述指标的监控，是否可有效预测乳腺癌的预后，仍需大量的临床资料加以证实。2.4 HER-2EDC的检测原癌基因HER-2（C-erbB-2,HER-2/neu)编码位于细胞膜上，分子量约为185kD的HER-2受体蛋白单体。HER-2蛋白的细胞膜外区（HER-2ECD）(Extracellular Domain）可从细胞膜上裂解下来作为抗原进入外周血循环中。乳腺癌肿瘤组织中HER-2/neu过表达常伴有患者血清中HER-2ECD水平升高。Jensen等15的统计结果显示，血清HER-2ECD水平升高患者身体不适，症状更严重，更易发生实质性器官转移，尤其是肝脏转移。Pichon等16也认为乳腺癌发生转移的部位不同，血清HER-2ECD的升高水平也不一样(P=0.0199)，其中以肝、肺转移水平最高。不同的作者评价血清HER-2ECD升高的参考值各不相同：Hayes等17认为10.5ng/ml；Meenakshi等18认为13.8ng/ml；Alis等19以15ng/ml作为升高标准；Schondorf等20以20ng/ml作为升高标准；但多数以15ng/ml作为升高标准。目前血清HER-2ECD检测一般以ELISA法高于15ng/ml作为升高标准，血清HER-2ECD的增高预示乳腺癌的恶性程度较高，能早期发现复发转移的乳腺癌，易发生内脏转移，尤其是肝、肺，以及对侧乳房转移，且生存期较短21。3 小结与展望 近几十年来对影响乳腺癌患者预后因素的研究，只有ER、PR是较成熟且公认较可靠的生物学指标，加上其他临床病理标准，如腋窝淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分期和患者年龄，可供临床医生选择用于判断乳腺癌预后的指标尤其是生物学指标并不多，合理的将多种预后指标联合运用可帮助临床医师对乳腺癌的预后和有无复发及转移作出更准确的判断，并指导选择更有效的治疗措施，将有助于乳腺癌的综合治疗及个体化治疗，提高乳腺癌患者生存率。 参考文献1 Racila E,Euhus D,Weiss AJ,et al.Detection and characterization of carcinoma cells in the bloodJ.Proe Natl Aead Sci USA,1998,1495(8):45892 丁波泥,陈道谨,吴君辉,等.乳腺癌中CA125、CA153的表达及意义J.中国医师杂志,2005,7(1):49-513 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