奶牛乳腺上皮细胞系的建立.pdf

畜牧兽医学报2 0 0 9 加 5 7 4 3 7 4 7 A c t aV e t e r i n a r i ae tZ o o t e c h n i c aS i n i c a 奶牛乳腺上皮细胞系的建立 陈建晖 佟慧丽 李庆章 高学军 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室 哈尔滨1 5 0 0 3 0 摘要 采用组织块种植法 成功地培养了奶牛乳腺上皮细胞 并利用细胞角蛋白1 8 的免疫荧光染色对乳腺上皮 细胞进行了鉴定 通过对细胞接种存活率 群体倍增时间 生长曲线 形态学等生物学性状的检测 建立并鉴定了 正常培养的奶牛乳腺上皮细胞系 细胞传至2 0 代以上时仍保持旺盛的增殖活力 通过对细胞传代及反复冻存 建 立了奶牛乳腺上皮细胞系 获得了大量的乳腺上皮细胞 关键词 奶牛 乳腺上皮细胞 细胞系 中图分类号 S 8 2 3 9 1文献标识码 A文章编号 0 3 6 6 6 9 6 4 2 0 0 9 0 5 0 7 4 3 0 5 E s t a b l i s h m e n to fD a i r yC o wM a m m a r yG l a n dE p i t h e l i a lC e l lL i n e C H E NJ i a n h u i T O N GH u i l i L IQ i n g z h a n g G A OX u e i u n K e yL a b o r a t o r yo fD a i r yS c i e n c eo fM i n i s t r yo fE d u c a t i o n N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y H a r b i n1 5 0 0 3 0 C h i n a A b s t r a c t T i s s u em a s si n o c u l a t i o nm e t h o dw a su s e di nt h i ss t u d y a n dm a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l so f d i a r yC O Ww e r es u c c e s s f u l l yc u l t i v a t e d m a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sw e r ei d e n t i f i e du s i n gc y t o k e r a t i n1 8i m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n g T h es u r v i v a lr a t eo fc e i l si n o c u l a t i o n d o u b l i n gt i m eo f c e l lp o p u l a t i o n g r o w t hc u r v e m o r p h o l o g i c a la n db i o l o g i c a lc h a r a c t e rw e r ed e t e c t e d a n di d e n t i f i c a t i o na n de s t a b l i s h m e n to fn o r m a lc u l t u r e dd a i r yC O Wm a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l l i n e sw e r es e tu p c e l lc o u l db ep a s s a g e d2 0g e n e r a t i o n sw i t hag o o db e h a v i o ro fp r o l i f e r a t i o n T h r o u g ht h ec e l lp a s s a g ea n dr e p e a t e d l yf r e e z e t h a w d a i r yC O Wm a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l ll i n e sw e r ee s t a b l i s h e d a n dal a r g en u m b e ro fm a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l sw e r ea c q u i r e d K e yw o r d s d a i r yC O W m a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l c e l ll i n e 乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的功能 是 制作乳腺生物反应器的靶细胞 体外培养的能合成 和分泌乳蛋白的乳腺上皮细胞具有方便 快捷且真 实反映乳腺在体内表达水平的功能 1 国际上对奶 牛乳腺上皮细胞培养的研究较早 其培养方法较复 杂 传代次数较少 尚处于初步研究 极少商品 化 2 5 国内对奶牛乳腺上皮细胞的培养也进行了 一些探索降引 但体外培养的细胞传代次数有限 没 有获得正常的奶牛乳腺上皮细胞系 因此 奶牛乳 腺上皮细胞系的建立 将为奶牛乳腺发育学 乳腺病 理学 乳腺生物工程学等相关研究奠定良好的基础 对进一步了解泌乳的调控机理以及验证乳腺表达载 体具有重要的意义 本研究中成功建立了奶牛乳腺上皮细胞系 获 得了大量的乳腺上皮细胞 为进一步在此方面的深 入研究提供了理论依据 l 材料与方法 1 1 试验材料 乳腺组织来自哈尔滨市成高子屠宰场屠宰的泌 乳后期健康的荷斯坦奶牛 收疆日期 2 0 0 8 0 3 2 4 基金项目 科技部 8 6 3 项目 2 0 0 6 A A l 0 2 1 A 4 作者简介 陈建晖 1 9 8 1 一 男 河南人 硕士生 主要从事基础兽医学研究 E m a i l c h e n j i a n h u i 一2 0 0 5 1 2 6 C O I T I 通讯作者 高学军 1 9 6 9 一 男 黑龙江人 教授 博导 主要从事乳业生物技术研究 T e l 0 4 5 1 5 5 1 9 0 2 4 4 E m a i l g a o x j 5 3 9 0 s i n a c 咖 万方数据 7 4 4 畜牧兽医学报 1 2 主要试剂 表皮生长因子 胰岛素 牛酪蛋白标准品均购自 S i g m a 公司 优质胎牛血清 D F l 2 培养基均购自 G i b c o 公司 细胞角蛋白1 8 抗体购自德国A c r i s 公 司 其他常规试验药品及试剂均为国产 1 3 主要仪器 C 0 培养箱 日本C O 1 5 0 型 D F C 2 8 0 倒置相 差显微镜 德国L E I C A T CS P 2A O B S 激光扫描 共聚焦显微镜 德国L E I C A C A S Y 细胞活力分析 仪 德国L E I C A 其他仪器均为国产 1 4 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养 无菌取倚斯坦奶牛乳腺组织 取材按常规手术 消毒乳房中部 切取少量乳腺组织块 置于含有5 胎牛血清的D F l 2 培养液的小瓶中 于冰盒中迅速 带回实验室 在超净工作台上分离修剪 用胁 H a n k s 液洗组织块3 5 次 直到洗净为止 尽量剥 离脂肪组织和结缔组织 将呈白色颗粒状的腺泡组 织尽量剪碎 组织块大约为1m m 3 用吸管将组织块 以适量的密度接种于铺有0 5 胶原活性蛋白的培 养瓶中 加入3m L1 5 D F l 2 完全培养液 于5 C 0 培养箱中3 7 培养 1 5 奶牛乳腺上皮细胞的传代培养和纯化 原代细胞培养至第3 天时 对细胞进行换液 以 后每隔1d 换液1 次 培养至第6 天左右时 少量成 纤维细胞开始从组织块周围出现 1 0d 左右时乳腺 上皮细胞开始从组织块周围生长 单层细胞融合至 培养底壁的9 0 左右 吸出原有培养液 根据上皮 细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶消化敏感性不同 在 混合生长的原代或传代细胞培养物中 经过0 2 5o A 胰蛋白酶的D H a n k s 液 3 7 消化 在倒置显微镜 下观察 待成纤维细胞质回缩 细胞问隙增大 脱离 瓶壁时 加培养液终止消化 将酶液倾出 离心后得 到的大部分是成纤维细胞 3 5 次选择传代 弃掉 组织块 可得到纯化的乳腺上皮细胞 1 6 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定 应用免疫荧光细胞染色法检测纯化后乳腺上皮 细胞角蛋白1 8 的表达情况 激光共聚焦显微镜下观 察 一抗染细胞角蛋白 P I 染核 细胞中的角蛋白1 8 染成绿色 细胞核染为红色 方法参考文献 9 1 7 奶牛乳腺上皮细胞生物性状的检测 根据每天对细胞生长情况的观察 记录奶牛乳 腺上皮细胞的生长特性和细胞形态的差异 对乳腺 上皮细胞做生物学性状的检测 细胞形态学观察 生长曲线 细胞接种存活率 细胞群体倍增时间 细 胞的冻存和复苏参照佟慧丽等的报道 1 0 2 结果与分析 2 1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养 当奶牛乳腺组织块培养到第6 天时 成纤维细 胞从组织块周围长出 图1 A 当组织块培养到第 1 0 天时 可看到成纤维细胞和乳腺上皮细胞的混合 生长 图l B 2 2 奶牛乳腺上皮细胞的传代培养和纯化 根据成纤维细胞和乳腺 皮细胞对胰蛋白酶的 敏感性不同 可得到纯化的奶牛乳腺上皮细胞 图 l C 和纯化的成纤维细胞 图卜D 2 3 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定 应用激光共聚焦显微镜观察 结果显示分离培 养的乳腺上皮细胞角蛋白1 8 的表达呈阳性 图2 图3 2 4 奶牛乳腺上皮细胞生物性状的检测 2 4 1 细胞形态学观察在细胞进行传代过程中 出现了不规则的多边形奶牛乳腺上皮细胞 图1 一 E 长形乳腺上皮细胞 图1 一F 蜂窝状的乳腺上皮 细胞 图l G 圆顶型的乳腺上皮细胞 图1 一H 含 有丰富乳滴的乳腺上皮细胞 图1 I 1 一J 和细胞出 现含有2 6 个核仁的乳腺上皮细胞 图1 K 拉网 结构的乳腺上皮细胞 图卜L 岛屿状的乳腺上皮 细胞 图1 一M 当细胞生长非常紧密时 出现细胞抑 制现象 图1 N 当细胞传到2 0 代时 细胞为长梭 形 图l 一0 2 4 2 细胞生长曲线以培养时间为横坐标 3 孔 细胞数的平均值为纵坐标绘制奶牛乳腺上皮细胞生 长曲线 图4 细胞生长曲线显示 奶牛乳腺上皮 细胞生长延迟期为O 5d 对数生长期为5 9d 9 d 后进入平台期 结果表明 培养的奶牛乳腺上皮 细胞具有正常的分裂增殖特性 符合细胞生长的生 物学规律 2 4 3 细胞接种存活率用对数生长期的细胞 通 过消化法制成细胞悬液 C A S Y 细胞活力分析仪计 数后 按每平皿5 7 1 0 5 个细胞接种 每组3 平皿 每2h 消化计数1 组已贴壁细胞 共观察2 4h 分1 2 次进行 结果表明 细胞贴壁率及存活率在2 4h 内 逐渐升高 并达到最高值9 2 以上 说明细胞的生 存及贴壁能力较强 表1 万方数据 5 期陈建晖等 奶牛乳腺上皮细胞系的建立 7 4 5 A 第6 天组织块周围出现成纤维细胞 1 0 0 B 第1 0 天左右组织块周围长出的乳腺上皮细胞和成纤 维细胞混合牛长 1 0 0 C 纯化的乳腺上皮细胞 2 0 0 D 纯化的成纤维细胞 2 0 0 E 不规则多 边形乳腺上皮细胞 2 0 0 F 长形的乳腺卜皮细胞 2 0 0 X G 蜂窝状的乳腺卜皮细胞 1 0 0 X H 圆 顶型的乳腺卜皮细胞 2 0 0 1 含乳滴的乳腺上皮细胞 2 0 0 J 含乳滴的乳腺上皮细胞 1 0 0 K 含2 6 枚核t 的乳腺上皮细胞 2 0 0 X L 拉网结构的乳腺上皮细胞 2 0 0 M 岛屿状乳腺上皮细胞 1 0 0 X N 抑制现象的乳腺上皮细胞 2 0 0 O 2 0 代处于分化状态的乳腺上皮细胞 2 0 0 A F i b r o b l a s t sa t6 d a y 1 0 0 t gM a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sa n df i b r o b l a s t sa t1 0 d a y 1 0 0 C M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sp u r i f i e d 2 0 0 X D F i b r o b l a s t sp u r i f i e d 2 0 0 E I r r e g u l a rp o l y g o n 2 0 0X F E l o n g a t em a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l s 2 0 0X G A l v e o l a t em a m m a r yg l a n de p i t h e l i a l c e l l s 1O OX H D o m e l i k em a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l s 2 0 0 I M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l s w i t he m u l s i o nd r o p s 2 0 0X J M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sw i t he m u l s i o nd r o p s 10 0 K M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sw i t h2 6n u c l e o l u s 2 0 0X L R e t i c u l a t em a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l s 2 0 0 M M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sl i k ei s l a n d s 1 0 0 N M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sr e s t r a i n e d 2 0 0X 0 D i f f e r e n t i a t i o nm a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sa t2 0p a s s a g e s 2 0 0X 图1奶牛乳腺上皮细胞形态 F i g 1S h a p eo fd i a r yC O wm a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l s 图28 代乳腺上皮细胞角蛋白1 8 染色 2 0 0 X F i g 2 C e r a t i n1 8s t a i n i n go fm a m m a r yg l a n d e p i t h e l i a lc e l l sa t8p a s s a g e s2 0 0X 图32 0 代乳腺上皮细胞角蛋白1 8 染色 1 0 0 F i g 3 C e r a t i n1 8s t a i n i n go fm a m m a r yg l a n d e p i t h e l i a lc e l l sa t2 0p a s s a g e s 1 0 0 万方数据 7 4 6 畜牧兽医学报4 0 卷 1 昌 七童 邑兽 口 越亏 稍 霎 最 图4 奶牛乳腺上皮细胞生长曲线 F i g 4 G r o w t hc u r v eo fd a i r yC O Wm a m m a r y g l a n de p i t h e l i a lc e l l 表1 细胞接种存活率 接种细胞数5 7 1 0 5 m L T a b l elC e l lp l a n t i n gs u r v i v a le f f i c i e n c y i n n o c u l a t i o nc e l l p o p u l a t i o n5 7 1 0 5 m L 接种时间 h 贴壁平均细胞数 1 0 5 细胞存活率 2 4 4 细胞群体倍增时间随着时间的增加 细胞 群体倍增时间逐渐减少 培养到第7 天时细胞群体 倍增时间达到最短 表明此时细胞增殖能力最强 随 后细胞倍增时间逐渐增加 表2 裹2 细胞群体倍增时间 接种细胞数3 1 0 5 m L T a b l e2C e l lp o p u l a t i o nd o u b l i n gt i m e i n n o c u l a t i o nc e l lp o p a l a t i o n3 1 0 5 m L l 接种时间 h 贴壁平均细胞数 1 0 5 群体倍增时间 h 2 4 5 细胞活力检测 对不同代数奶牛乳腺上皮 细胞反复进行冻存 冻存复苏后检测到细胞活力均 达8 9 以上 细胞接种率达9 2 以上 且复苏后的 奶牛乳腺上皮细胞密度较大 形状规则 边缘整齐 折光率好 贴附于培养底壁上 具有良好的贴壁及生 长趋势 图5 图6 图5 复苏0h 后的乳腺上皮细胞1 0 0 F 嘻5 R e s u s c i t a t i o no fm a m m a r yg l a n dc e l l s a f t e r0h o u r1 0 0 圈6 复苏2 4h 后的乳腺上皮细胞2 0 0 F 唔6 R e s u s c i t a t i o no fm a m m a r yg l a n dc e l l s a f t e r2 4h o u r s2 0 0 3 讨论 有泌乳功能的乳腺上皮细胞系既可以用来研究 乳蛋白基因表达及乳汁分泌机制 9 又可以作为研 究于乳期细胞凋亡及乳腺退化的宝贵材料 但奶牛 乳腺上皮细胞的体外培养比较困难 给乳腺上皮细 胞分化增殖的进一步研究带来极大不便 本研究发 现 要想获得较纯的奶牛乳腺上皮细胞 取材是最关 键的一步 由于乳腺组织与其它组织的颜色 界限分 辨不是十分清晰 所以取材过程中一定要特别避免 淋巴结 肌腱 脂肪等非乳腺组织的掺入 从而避免 培养过程中淋巴细胞和成纤维细胞的污染 此外 在妊娠的中晚期或哺乳期 乳腺腺泡数量最多 是乳 腺上皮细胞取材的最佳时期 乳腺上皮细胞生物学功能的分化取决于细胞与 细胞外基质的相互作用 应用鼠尾胶原或胶原蛋白 处理过的培养皿进行乳腺上皮细胞的原代培养已经 成为一种普遍采用的方法 胶原蛋白对于原代乳腺 细胞培养时细胞的贴壁和展开都有促进作 用H 8 2 1 本试验使用的0 5 的胶原蛋白铺底对 万方数据 5 期 陈建晖等 奶牛乳腺上皮细胞系的建立 7 4 7 原代乳腺上皮细胞的贴壁和展开具有明显作用 获 得了较理想的培养效果 另外 体内多种激素成分 共同作用于乳腺组织 促进上皮细胞的生长及分化 缺乏任何一种因子或激素 其它激素也会部分或全 部失去作用D 3 3 胰岛素能增加乳腺上皮细胞的贴壁 率和伸展H4 氢化可的松对维持乳腺上皮细胞的生 长也是必需的 正常乳腺上皮细胞的增殖分化涉及 到类固醇 生长因子 胰岛素 结合蛋白及细胞外基 质的相互作用 1 引 本试验选用的含1 5 的胎牛血 清 5 肛g m L 1 胰岛素 5p g m L 1 表皮生长因 子 1 g m L 1 氢化可的松 1 0 0I U m L 1 青链霉 素的D M E M F 1 2 培养液 细胞增殖分化良好 活力 旺盛 能够传至2 0 代以上 说明此培养液是乳腺上 皮细胞较为理想的培养液 乳腺上皮细胞的原代培养方法主要为组织块接 种法和胶原酶消化法 本试验在奶牛乳腺上皮细胞 的原代培养时 也试图用胶原酶消化法或奶汁进行 培养 均未获得成功 这与R o s e 等报道的不一致 2 这可能是与胶原酶适时消化的程度和乳腺取材有很 大关系 用组织块接种法成功的获得了纯化的奶牛 乳腺上皮细胞 但组织块长出乳腺上皮细胞的时间 较晚 在6d 时 看到长形的成纤维细胞从组织块周 围长出 1 0d 时 看到乳腺上皮细胞从组织块周围 出现 与杜娟等报道相似 7 乳腺上皮细胞能够反复 冻存和复苏 获得了大量的奶牛乳腺上皮细胞 这主 要与选用的冻存保护液中添加了较强保护能力的 H E P E S 有关 1 引 建立正常的奶牛乳腺上皮细胞 系 结果较理想 当细胞传代到2 0 代时 失去了乳 腺上皮细胞的形态 逐渐趋向于长梭形 但细胞分化 增殖良好 其分化的细胞是否具有乳蛋白的基因表 达还有待进一步探讨 参考文献 1 X UMN L ISG Z H A OJY e ta 1 T h ed e t e c t i o n m e t h o do fm a m m a r yg l a n db i o r e a c t o re x p r e s s i o nv e c t o r E J B i o t e c h n o lB u l l 2 0 0 3 5 2 3 2 6 2 R O S EMT A S OH Y O N E K U R AS e ta 1 I n v i t r od i f f e r e n t i a t i o no fac l o n e db o v i n em a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l E J JD a i r yR e s 2 0 0 2 6 9 3 3 4 5 3 5 5 3 S A K A M o T oK K O M A T S UT K O B A Y A S H IT e ta 1 G r o w t hh o r m o n ea c t so nt h es y n t h e s i sa n ds e c r e t i o no fa l p h a c a s e i ni nb o v i n em a m m a r ye p i t h e l i a l c e l l s F J JD a i r yR e s 2 0 0 5 7 2 3 2 6 4 2 7 0 4 B U E H R I N GGC C u l t u r eo fm a m m a r ye p i t h e l i a l c e l l sf r o mb o v i n em i l k J D a i r yS c i 19 9 0 7 3 9 5 6 9 6 3 5 W E L L N I T ZO K E R RDE C r y o p r e s e r v e db o v i n e m a m m a r yc e l l st Om o d e le p i t h e l i a lr e s p o n s et Oi n f e e t i o n J V e tI m m u n o lI m m u n o p a t h o l 2 0 0 4 1 0 1 3 4 1 9 1 2 0 2 6 王亨 韩超 邱昌伟 等 体外培养奶牛乳腺上 皮细胞的形态学观察 J 中国兽医杂志 2 0 0 7 4 3 6 1 5 1 7 7 杜娟 狄和双 王根林 奶牛乳腺上皮细胞系的建 立及高温对细胞超微结构的影响 J 生物工程学 报 2 0 0 7 2 3 3 4 7 1 4 7 6 8 多曙光 吴应积 罗奋华 等 牛乳腺上皮细胞的分 离培养及其生物学特性口 动物学研究 2 0 0 6 2 7 3 2 9 9 3 0 5 9 W H E E L E RTT C A L L A G H A NMR D A V I SSR e ta 1 M i l kp r o t e i ns y n t h e s i s g e n ee x p r e s s i o n a n d h o r m o n a lr e s p o n s i v e n e s si np r i m a r yc u l t u r e so fm a m m a r yc e l l sf r o ml a c t a t i n gs h e e p J E x pC e l lR e s 1 9 9 5 2 1 7 2 3 4 6 3 5 4 1 0 佟慧丽 尹德云 高学军 等 奶山羊乳腺上皮细胞系 的建立 中国科技论文在线 2 0 0 7 2 0 0 7 0 5 0 6 h t t p w w w p a p e r e d u c n 11 3V I A N D E RB A L A u 0 T I L AS J A L K A N E DM e t a 1 V i a b l eA C 一2 an e wa d u l tb o v i n es e r u m a n dc o l o s t r u m b a s e ds u p p l e m e n tf o rt h ec u l t u r eo fm a m m a l i a n c e l l s J B i o t e c h n i q u e s 1 9 9 6 2 0 7 0 2 7 0 7 1 2 L I NCQ B I S S E L LMJ M u l t i f a c e t e dr e g u l a t i o no f c e l ld i f f e r e n t i a t i o nb ye x t r a c e l l u l a rm a t r i x J T h e F A S E BJ o u r n a l 1 9 9 3 7 7 3 7 7 4 3 1 3 1 B U L L O C KLP B A R T H EPL M O W A Z O W I C ZI e ta 1 T h ee f f e c t so fp r o g e s t i n so ns u b m a x i l l a r yg l a n d e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r d e m o n s t r a t i o no fa n d r o g e n i c s y n a n d r o g i e n i ca n da n t i a n d r o g e n i ca c t i o n s J E n d o c r i n o l o g y 1 9 7 5 9 7 1 8 9 1 9 5 1 4 L A M O T El M E Y E RE M A S S A R T L EAM e t a 1 S e xs t e r o i d sa n dg r o w t hf a c t o r si nt h er e g u l a t i o n o fm a m m a r yg l a n dp r o l i f e r a t i o n d i f f e r e n t i a t i o n a n d i n v o l u t i o n E J S t e r o i d s 2 0 0 4 6 9 1 4 5 1 5 9 1 5 W O O D W A R DTL X I EJ F E N D R I C KJL e ta 1 P r o l i f e r a t i o no fm o u s em a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l si n v i t r o I n t e r a c t i o n sa m o n ge p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r i o v a r i a nh o r m o n e s a n d e x t r a c e l l u l a rm a t r i xp r o t e i n s J E n d o c r i n o l o g y 2 0 0 0 1 4 1 1 0 3 5 7 8 3 5 8 6 万方数据 奶牛乳腺上皮细胞系的建立奶牛乳腺上皮细胞系的建立 作者 陈建晖 佟慧丽 李庆章 高学军 CHEN Jian hui TONG Hui li LI Qing zhang GAO Xue jun 作者单位 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室 哈尔滨 150030 刊名 畜牧兽医学报 英文刊名 ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA 年 卷 期 2009 40 5 被引用次数 3次 参考文献 15条 参考文献 15条 1 VIANDER B ALA UOTILA S JALKANED M Vfable AC 2 a new adult bovine serum and colostrum based supplement for the culture of mammalian cells 1996 2 佟慧丽 尹德云 高学军 奶山羊乳腺上皮细胞系的建立 2007 3 XU M N LI S G ZHAO J Y The detection method of mammary gland bioreactor expression vector 2003 4 WHEELER T T CALLAGHAN M R DAVIS S R Milk protein synthesis gene expression and hormonal responsiveness in primary cultures of mammary cells from lactating sheep 外文期刊 1995 02 5 多曙光 吴应积 罗奋华 牛乳腺上皮细胞的分离培养及其生物学特性 期刊论文 动物学研究 2006 03 6 杜娟 狄和双 王根林 奶牛乳腺上皮细胞系的建立及高温对细胞超微结构的影响 期刊论文 生物工程学报 2007 03 7 王亨 韩超 邱吕伟 体外培养奶牛乳腺上皮细胞的形态学观察 期刊论文 中国兽医杂志 2007 06 8 LIN C Q BISSELL M J Muhifaceted regulation of cell differentiation by extracellular matrix 1993 07 9 WELLNITZ O KERR D E Cryopreserved bovine mammary cells to model epithelial response to infection 外文期刊 2004 3 4 10 BUEHRING G C Culture of mammary epithelial cells from bovine milk 1990 11 SAKAMOTO K KOMATSU T KOBAYASHI T Growth hormone acts on the synthesis and secretion of alpha casein in bovine mammary epithelial cells 外文期刊 2005 03 12 ROSE M T ASO H YONEKURA S In vitro differentiation of a cloned bovine mammary epithelial cell 外 文期刊 2002 03 13 WOODWARD T L XIE J FENDRICK J L Proliferation of mouse mammary epithelial cells in vitro Interactions among epidermal growth factor insulin like growth factor 1 ovarian hormones and extracellular matrix proteins 外文期刊 2000 10 14 LAMOTE I MEYER E MASSART LE A M Sex steroids and growth factors in the regulation of mammary gland proliferation differentiation and involution 外文期刊 2004 15 BULLOCK L P BARTHE P L MOWAZOWICZ I The effects of progestins on submaxillary gland epidermal growth factor demonstration of androgenic synandrogienic and antiandrogenic actions 外文期刊 1975 本文读者也读过 10条 本文读者也读过 10条 1 陈建晖 高学军 李庆章 CHEN Jianhui GAO Xueju