嗜热四膜虫金属硫蛋白MTT1和MTT2的重组表达和功能分析.doc

嗜热四膜虫金属硫蛋白MTT1和MTT2的重组表达和功能分析【摘要】：金属硫蛋白MT(Metallothionein)是一类低分子量(6-7kDa)、富含半胱氨酸并能够螯合金属离子的蛋白。MT可以通过螯合重金属离子(Cd、Hg等)保护机体,解除毒害,同时参与调节体内必需金属元素(Cu、Zn等)的正常新陈代谢,金属硫蛋白还具有清除体内自由基的功能。嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)拥有不同的MT亚型,为金属硫蛋白研究提供了良好的模式系统。本研究主要对嗜热四膜虫金属硫蛋白MTT1和MTT2进行了体内功能分析,研究结果如下：1本研究通过PCR扩增了MTTl和MTT2基因,构建了重组质粒pGEX-MTT1和pGEX-MTT2,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达了GST-MTT1和GST-MTT2蛋白。大肠杆菌BL2l/pGEX-MTTl中GST-MTT1的表达提高了细胞对Cd2+的耐受性,表明MTT1具有解除Cd2+毒性的功能。而大肠杆菌BL21/pGEX-M7T2中GST-MTT2的表达显著提高了细胞的增殖和对Cd2+/Cu2+的耐受性,表明MTT2具有促进细胞新陈代谢并参与细胞对Cd2+/Cu2+解毒的功能。2为了分析两类金属硫蛋白之间的关系,本研究分别构建了MTT1-MTT3和MTT2-MTT4的基因敲除载体,通过同源重组获得敲除大核MTT1-MTT3和MTT2-MTT4的两种嗜热四膜虫突变体细胞株MTT1-MTT3和MTT2-MTT4,两种突变体细胞株暴露在Cd2+、Cu2+和H202的生长表现出显著不同,MTT1-MTT3突变体细胞对Cd2+的耐受性显著下降,而MTT2-MTT4突变体细胞对Cu2+和H202的耐受性均显著下降。实时荧光定量PCR分析不同突变体中其它MTT因的表达变化,在MTT2-MTT4突变体细胞株中,MTT5的表达水平下调,在500MCu2+处理后,MTT2-MTT4突变体细胞中MTT1、MTT3和MTT5表达相对野生型分别上调6.1,9.5和8.5倍。在MTT1-MTT3突变体细胞中,MTT2,MTT4和MTT5的表达水平下调,当5MCd2+处理后,MTT1-MTT3突变体细胞株MTT5表达水平相对野生型上调2.9倍,相反,MTT2和MTT4表达水平相对野生型分别下降了4.9倍和2.5倍。结果表明嗜热四膜虫中的金属硫蛋白MTT1、MTT3和MTT5主要参与细胞的重金属解毒功能；而MTT2和MTT4主要参与细胞内正常的新陈代谢功能,不同的金属硫蛋白基因之间的表达存在相互调控和功能补偿。【关键词】：嗜热四膜虫金属硫蛋白重组表达基因敲除【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q51【目录】：中文摘要9-10ABSTRACT10-12第一章文献综述12-221.1金属硫蛋白的研究进展12-181.1.1金属硫蛋白的理化性质121.1.2金属硫蛋白的结构12-131.1.3金属硫蛋白的调控13-151.1.4金属硫蛋白的功能15-181.2嗜热四膜虫金属硫蛋白的研究进展18-201.2.1嗜热四膜虫18-191.2.2嗜热四膜虫是研究金属硫蛋白的良好模式生物19-201.3本项研究工作的目的和意义20-22第二章嗜热四膜虫金属硫蛋白MTT1和MTT2在大肠杆菌中的重组表达及活性分析22-322.1材料22-242.1.1菌株和质粒222.1.2试剂与工具酶22-232.1.3主要实验仪器232.1.4主要试剂配制23-242.2方法24-272.2.1MTT1和MTT2基因的克隆24-252.2.2pGEX-MTT1和pGEX-MTT2表达载体的构建25-262.2.3GST-MTT1和GST-MTT2在大肠杆菌中的表达分析262.2.4大肠杆菌BL21/pGEX-MTT1和BL21/pGEX-MTT2的细胞增殖分析26-272.3结果27-312.3.1MTT1和MTT2基因的克隆272.3.2pGEX-MTT1和pGEX-MTT2表达载体的构建27-282.3.3融合蛋白GST-MTT1和GST-MTT2在大肠杆菌中的表达282.3.4大肠杆菌BL21/pGEX-MTT1和BL21/pGEX-MTT2对Cd(2+)和Cu(2+)的耐受性28-312.4讨论31-32第三章嗜热四膜虫中两类不同金属硫蛋白的功能补偿分析32-503.1材料32-333.1.1菌株和质粒323.1.2试剂与工具酶32-333.1.3主要实验仪器333.1.4主要试剂配制333.2方法33-423.2.1嗜热四膜虫敲除载体pN-MTT1-3和pN-MTT2-4的构建33-373.2.2嗜热四膜虫细胞的转化、筛选和鉴定37-413.2.3MTT1-MTT3和MTT2-MTT4细胞株在Cd(2+)、Cu(2+)和H_2O_2胁迫下的生长比较41-423.2.4嗜热四膜虫突变体细胞中MTT1、MTT2、MTT3、MTT4和MTT5的表达分析423.3结果42-483.3.1嗜热四膜虫MTT家族基因的序列分析42-433.3.2嗜热四膜虫敲除载体pN-MTT1-3和pN-MTT2-4的构建43-443.3.3MTT1-MTT3和MTT2-MTT4突变体细胞株的构建与鉴定44-463.3.4MTT1-MTT3和MTT2-MTT4突变体细胞在Cd(2+)、Cu(2+)和H_2O_2下的增殖比较46-473.3.5两类MT家族基因在MTT1