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文档简介
环核苷酸门控通道的研究进展 1976 年Noma 首次报道在家兔心脏窦房结组织记录到一种超极化激活的内向电流,称为If1 。超极化电流(If)是心肌舒张期去极化的主要决定因素,并且在心率控制及神经递质对心率的调节中起着非常重要的作用。自描述If后长达30年的时间内都未能实现其通道克隆,直到最近超极化激活的环核苷酸门控通道(hyperpo;arization-activated cyclid nucleotide-geted channel,HCN)亚单位的克隆才为理解If通道特性提供了分子基础,本文对编码If电流的HCN通道的研究进展做一综述。1 环核苷酸门控通道基础研究1、1 环核苷酸门控通道及结构: 1997 年, Santoro2 等人在寻找与神经Src 基因SH3结合区作用的蛋白时利用酵母双杂交法从小鼠脑中克隆到一个新的通道家族。HCN 通道在If 电流被发现3 年后才得以在这样偶然的情况下实现了其克隆。之后利用RT2PCR和cDNA 库扫描技术在哺乳类克隆到4 个异构型( HCN1HCN4), 所有的4个异构型在脑中均有表达, 而心脏仅发现HCN1、HCN2和HCN4的表达3 。尽管不同异构型动力学特征各异, 但它们所产生的电流都具有典型的If 电流特征, 即超极化激活, 钠钾离子混合通透, 胞内cAMP 的直接调节以及微弱的单通道电导。HCN通道包括6个跨膜区(S1S6), 其中带高度正电荷的S4区起着电压感受器的作用4 , 并且在S5与S6之间的孔道P区还具有大多数钾离子选择性通道标志性的GYG序列, 但是P区除GYG序列外的氨基酸和钾离子选择性通道是不一样的, 这也解释了HCN 通道的钠钾混合通透。HCN 通道C 末端都包含一个环核苷酸结合区(CNBD) , 该区能与cAMP 结合而调节If 通道的电压依赖性, 但并不是通道激活所必需。HCN 通道家族在从S1 区到CNBD 之间的核心区域都是高度保守的, 而在N 末端和C 末端长度及序列均差异较大5 。HCN 通道与电压门控性钾通道( Kv 通道) 结构有很多相似的地方, 如6 个跨膜区段, 特别是同样包含带正电荷的S4 区, 但是HCN 通道的超极化激活的特性却不同于Kv 通道等电压门控通道, 这在很长一段时间内令人费解。2002年, Mannikko 等人通过半胱氨酸替代的方法检测了不同条件下S4 氨基酸残基的离子通透特性。从而解决了这个问题。实验发现S4 区近端对细胞外侧的离子通透, 而远端对内侧的离子通透, 而中部至少有一个残基在超极化条件下对细胞外侧的离子通透而去极化条件下对内侧离子通透。HCN 通道与Kv 通道的S4 区结构没有区别, 但是在HCN 通道中外向离子流导致S4 区阀门的关闭而内向离子流可以诱发阀门的开放, 这与Kv 通道刚好是相反的。1、2 HCN 通道的动力学特征: 不同的HCN 通道异构型离子选择性及药理学特性都很相近, 主要的差异表现在动力学特征和cAMP 激活的强度不同。HCN1 具有最快的动力学特征, 在正常的静息电位除极达到阈电位大约需要25 300ms , HCN2 及HCN3 大约180 500ms , HCN4 最慢,在约- 140mV 的静息电位水平下需要几百毫秒, 而正常的静息电位水平则需要长达数秒钟的时间。平均激活曲线的半最大电压虽然由于实验条件等原因的影响, 文献报道数值差异较大, 但亦表现为HCN2 最负6 。不同的HCN 通道异构型可组装成多聚体, 除同源多聚体, HCN1 和HCN2 尚可形成异源多聚体, 形成的多聚体其动力学特征介于两者之间。1、3 HCN 通道的调节: HCN 通道受多种神经递质及代谢产物的调节, 这种调节都依赖于对电压依赖性的改变7 。如上所述, cAMP 能使If 激活曲线向正电压方向移动, 从而加快心率。而乙酰胆碱则通过抑制cAMP 的合成达到相反的效果。这种作用不依赖于磷酸化作用。1999 年Page8 等的研究发现HCN 通道的活性受胞内p H 值影响。酸性环境下通道活性弱, 而碱性环境下活性强。这也导致很多的生理活动与HCN 通道的活性相关, 如丘脑摆动, 呼吸频率。而酸中毒时HCN 通道活性的减弱也成了心力衰竭和心肌梗死一个重要的病理条件。Zong9 等人通过定向突变的技术将小鼠HCN2 通道上的pH 值感受器定位于一个组氨酸残基。1、4 环核苷酸门控通道的异构型分布: 如前所述, 哺乳动物四种HCN 通道亚型中目前只有HCN1 、HCN2 及HCN4三种亚型在心脏发现表达。但是各个亚型表达的区域及量差异较大。在鼠类及兔子的窦房结中, HCN4 是主要的亚型,这提示这一亚型在起搏电流的关键作用。少量的HCN1 和HCN2 也存在于窦房结。在浦肯野纤维, HCN4 也是主要的异构型。普通的心房和心室肌细胞也可表达HCN 通道,HCN2 是主要的异构型, 在人和鼠类的心房和心室肌细胞中还有少量的HCN4 表达, 而兔则无。2、环核苷酸门控通道临床研究Juliane10等人通过敲除小鼠HCN2 、HCN4 及应用If阻滞剂研究HCN 通道与窦房结心律失常的关系。实验表明, HCN2 敲除小鼠RR 间期不规律, 但最快心率亦慢于正常心率, 而PQ、QRS、QT 间期及波形均不变, HCN2 敲除小鼠对cAMP 的反应与正常小鼠无异, 提示HCN2 不参与交感神经对心率的调节。HCN4 敲除小鼠明显减慢心率,但无心律不齐; 无明显的结构异常, 但收缩比较正常小鼠减小40 % , 且cAMP 的应用不能纠正这一减少。动作电位记录提示HCN4 敲除小鼠仅能形成“原始”的动作电位而不能形成“成熟”的起搏电流。表明HCN4 是正常起搏电流产生的重要因素, 也是基本心率的决定因素。在HCN 通道被发现之前, 研究人员21通过兔窦房结细胞动作电位记录就发现某些特定物质可以减少(并不消失)4 期的缓慢除极从而引起心率减慢而不导致心律失常。进一步的膜片钳研究发现该物质引起If 电流阻滞, 而且这种阻滞是功能依赖型的, 仅在心率高于一定程度才发挥作用。研究发现低剂量西洛雷定(一种If 阻滞剂) 可减慢心率而不导致心律失常, 而到达一定剂量后再增加剂量心率不会继续减慢并出现心律失常, 有趣的是这种心律失常的类型类似于HCN2 敲除小鼠的心律。应该指出, 目前关于If 改变与心脏疾病相关的直接证据还很少, If 改变是否是疾病的直接致病因素尚有待进一步研究和探讨。参 考 文 献 1 Potapova I,Plotnikov A ,Lu Z ,et al.Human mesenchymal stem cells as a gene delivery system to create cardiac pacemakersJ . Circ Res ,2004 ,94(7) :952.2 Santoro B , Grant SG, Bartsch D , et al . Interactive cloning withthe SH3 domain of N-src identifies a new brain specific ion channelprotein , with homology to eag and cyclic nucleotide2gated chan-nels. Proc Natl Acad Sci , 1997,94:1481514820.3 Gauss R , Scifert R , Kaupub B. Molecular identification of a hy-perpolarization2activated channel in sea urchin sperm. Nature ,1998 , 393 : 583591.4 Chen J , Mitcheson J S , Lin M , et al . Functional roles ofcharged residues in t he putative voltage sensor of t he HCN2 pace2maker channel . J Biol Chem , 2000 , 275 : 36 , 46536 , 471.5 Blondel O , Vandecasteele G, Gastineau M , et al . Molecularand functional characterization of a 52HT4 receptor cloned f romhuman at rium. FEBS Lett , 1997 , 412 : 465474.6 Kaumann AJ , Sanders L. 52hydroxyt ryptamine causes rate2de2pendent arrhyt hmias t hrough 52HT receptors in human at rium:facilitation by chronic 2adrenoceptor blockade. NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol , 1994 , 349 : 331337.7 Shamil Y. 52hydroxyt ryptamine and at rial fibrillation : how sig2nificant is t his piece in t he puzzle. Journal of Cardiovascular E2lect rophysiology , 2003 , 14 (2) : 209217.8 Page HC , Munsch T. Modulation of t he hyperpolarization2acti2vated cation current of rat t halamic relay neurones by int racellu2lar p H. J Physiol , 1999 , 519 : 493504.9 Zong X , Stieber J , Ludwig A , et al . A single histidine residuede
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