活性氮-4.ppt

第四章活性氮在机体内的产生及其转化 一 NO研究历史二 NO的合成 代谢 体内分布三 NO合酶 NOS 四 NO的理化性质及生物功能五 NO产生异常和疾病六 NO的测定方法七 NO与细胞凋亡 一NO研究历史 1935年 英国化学家Davy发现NO有毒 用于战争 1979年 美国著名的循环药理学家F Murad提出可能与血管平滑肌松弛有关 1980年 美国杰出的生理学家R Furchgott建立了NO的研究领域发现在血管平滑肌内皮细胞完好无损的情况下 血管内皮细胞产生了某些未知的因子 可以松弛平滑肌和引起扩张 1986年 R Furchgott和L Ignarro 美国科学家 EDRF NO 1987年 L Ignarro和Moncada 英国杰出生命科学家 EDRF NO或NO衍生物 1988年 MoncadaNO与L 精氨酸的联系NOS 1990年 日本科学家分离出了NOS 1992 1993年 完成了NOS三种编码基因的染色体定位 NO被选为1992年度的明星分子 Themoleculeoftheyear Nature RNS reactivenitrogenspecies 自由基nitrogen II oxide NO nitrogen IV oxide NO2 非自由基nitrosyl NO nitrousacid HONOnitogen III oxide N2O3peroxynitrite ONOO alkylperoxinitrite ROONO ps pp ss pp ps ss Ss ss NO NO 15e 21S 2 1S 22S 2 2S 22P 42P 1 2P NO 1 2P NO NO 活性氮 NO 15e 21S 2 1S 22S 2 2S 22P 42P 1 2P 顺磁性电中性易于扩散易于通过细胞膜能溶于水有脂溶性 血管扩张剂 活化G蛋白 启动磷脂肌醇通路 释放Ca2 激活CaM 激活NOS L ArgNADPHO2 NO 二NO的合成 代谢 体内分布 L Arg N OH L Arg L 精氨酸 L Citr NO L 胍氨酸 NADPHNADP O2 NOS O2 NO2 NO2 NO3 合成 代谢 体内分布 多种组织和细胞能合成内源性NO 神经系统 主要是神经元 是动物体内源性NO合成的重要场所 三NO合酶 NOS 是生成NO的必需物质位于细胞内分子量 15000不同组织中NOS存在差别至少存在三种类型 型cNOS 固有型 神经元型 依赖于钙和钙调蛋白 Ca2 CaM Ca2 50nmol L无活性 Ca2 0 1 1 mol L活性最大存在于神经元 脑表皮细胞中是一种单体酶蛋白分子 也是一种固体酶溶于胞质 分布于脑及外周神经组织中 型iNOS 诱导型 生理条件下表达水平较低 细胞受刺激时表达增多不依赖于钙和钙调蛋白 Ca2 CaM 巨噬细胞中的诱导酶 溶于胞质作用时间长 是造成组织损伤的主要原因 分布于巨噬细胞 中性粒细胞 纤维细胞 脂肪细胞 肝细胞肿瘤细胞 型eNOS 固有型 上皮型 分布于血管内皮细胞 血小板 依赖于钙和钙调蛋白 Ca2 CaM 作用时间短 激活时立即合成释放NO主要参与信使调控 扩血管等功能正常情况下具有脑保护作用 在大量生成时具有细胞毒性 介导早期神经元损伤 四NO的理化性质及生物功能 顺磁性化学性质活泼 信使功能分子细胞毒性分子 NO的化学 生物学行为 NO是氮中心自由基 NO氧化2 NO O2 2 NO2NO的化学活泼性接近氧分子 体内NO水平高于超氧自由基 多数组织暴露于NO 氧化剂 还原剂NO与过渡金属离子配位 多数生理作用与配位化学有关 NO能与大多数自由基反应 扩散限速 NO终止链反应生成过氧亚硝酸HOONO Joe Beckman ccc uab edu NO活泼 t1 2 3 5s Cu2 Mg2 Fe2 O2O2 2NO O2 2NO2 NO O2 ONOO 稳定 生理PH NO2 OH H NO3 OH 过氧亚硝基阴离子 Fe2 Fe3 Mn NO M NO n 过氧亚硝酸的形成和分解 OONO H HOONOpK 6 8HOONO OH NO2 非自由基 两面性 OONO生成亚硝酰 引起硝基化 OONO氧化 引起硝基化 OONO分子内氧化还原生成硝酸根 Freinetal BiochemicalPharmacology70 2005 811 823 O2 和 NO的相互制约 NO2的基本性质 二聚 水解2 NO2 N2O4 O 转移 NO2 CO3 NO3 CO2氧化 NO2 targetred NO2 targetox NO GC GC NO鸟苷酸环化酶GC的活化状态 GTPCGTPCGMP GC NO 三磷酸鸟苷磷酸鸟苷环化环磷酸鸟苷 信使功能分子 生成速度加快50 200倍 Fe2 亚硝酰基 血红素 酶蛋白 ROS RNS的一个重要性质 半衰期 ROS RNS间的化学关系 O2 电子转移 氧化还原 ONOOH NO和GC的结合代表一种新的广泛存在的将细胞外信息转导为邻近细胞内的第二信使cGMP 增加信息传递机制 NO在一个细胞内产生后 便可调控周围细胞的功能 局部调节着对立的或互补的细胞反应 NO作为信使分子的最大特点是它不需要任何中介机构而快速扩散通过细胞膜 将一个细胞产生的信息传递到它周围的细胞中去 而主要的影响因素是NO的生物半衰期 NO的生物信使功能 1 对心 脑 血管系统的调节2 对神经系统的调节作用3 对性行为的调节作用4 在免疫系统中的功能 NOS分布在动脉 冠状动脉和脑血管等外壁中 调节血压 血流和脑血屏障通透性GC存在于脑部微血管中 1 对心 脑 血管系统的调节 CGMP可以使血管平滑肌松弛 引起血管扩张 降低血压 抑制血小板凝聚和粘附到内皮细胞上 2 对神经系统的调节作用 NO作为突触前递质 从神经末梢释放 也可作为突触后逆信使 在突触后体生成 逆行扩散到突触体前区 在神经系统信息传递和发育中起作用NO是周边神经系统中的新递质 传导嗅觉信息 参与痛觉传入NO是自主神经系统中的递质 在哺乳类消化 生殖 呼吸和循环四个系统的自主神经调节中起作用 NO在神经内分泌中的作用 在垂体后叶的神经末梢中有NOS存在 可调节激素释放NO可以兴奋神经元 在学习和记忆中起作用 3 对性行为的调节作用 4 在免疫系统中的功能 NOS分布于支配阴茎平滑肌的神经元中 内源性NO是吞噬细胞发挥杀伤靶细胞效应的信使分子在免疫杀伤过程中释放活性氧和活性氮 NO O2 ONOO NO2 OH H 细胞毒性分子 机理1 NO O2 ONOO 氧化能力比H2O2强1000倍 吞噬细胞吞噬过程中释放大量的O2 NO2 OH H NO3 OH 可以扩散到较远的距离 细胞毒性分子机理2 NO 金属蛋白酶 Fe2 失活 影响或抑制细胞代谢 细胞死亡 NO对能量代谢的抑制 1 NO抑制非血红素铁硫酶类活力 NO 酶 Fe2 SH 酶 Fe2 NO SH 2 抑制糖酵解 NO能修饰3 磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH GAPDH生理条件下催化糖酵解GAPDH内源性修饰抑制了糖酵解过程 SH NO SH NO对DNA结构及合成的影响 1 NO对DNA结构的影响 NO DNA分子脱氨基 DNA序列的碱基突变 DNA断裂 2 NO对DNA合成的影响 NO 抑制核糖核苷酸还原酶 RNR DNA生物合成的中断 NO破坏锌 硫中心导致锌释放 NO在组织缺血再灌注中的损伤作用 NO介导谷氨酸的神经毒性作用 影响DNA的转录和复制 NO有双重作用 即可以松弛血管 抑制组织中的梗塞面积 减少组织坏死 又可以与氧自由基协同 加重缺血再灌注损伤NO O2 ONOO NO在中风引起的神经元损伤中起重要作用 五NO产生异常和疾病 原发性高血压 NO生成缺陷 六NO的测定方法 EPR 加入L Arg检测NO Griess试剂 对氨基苯甲酸 萘基 乙二胺 生物组织中的NO 细胞培养上清液中的NO NOS活性测定 放射强度测定法 3H Arg L 精氨酸 3H Citr NO L 胍氨酸 NOS 液体闪烁计数仪 分光光度测定法 双波长分光光度计 Hb O2 NO Hb O2 N2O 401 421nm 七 NO与细胞凋亡 细胞凋亡 细胞的正常死亡 是以形态学和生物化学特征作为定义标准的微绒毛丢失 细胞与细胞粘连 细胞皱缩 出现凋亡小体 NO可以参与多种细胞凋亡过程 胸腺细胞 正常 凋亡 细胞凋亡与疾病发生机制的新认识 1 该 死 的细胞 如肿瘤细胞 自身反应性免疫细胞 未死 是造成肿瘤 自身免疫性疾病的主要发病机制之一 细胞凋亡不足2 不该 死 的细胞 如神经元 心肌细胞 死了 这与老年性痴呆 心肌缺血 再灌注损伤等发病有关 细胞凋亡过度 Tama