病理科诊疗常规.doc

第八十二章 病理科操作技术第一节 活体组织检查送检标本1.送检标本于手术切除后，必须立即投入10%甲醛中固定。大型标本在不妨碍病理检查情况下切开固定，固定液量约为标本体积的34倍或以固定液盖过标本为宜。直径不超过1cm者可用“8:1:1”固定液固定，固定液量约为标本体积的2030倍，使标本在固定液中能自由浮动即可。需作特殊物质显示的标本可与本室联系给予适当的固定液加以固定。标本容器应使用广口加盖者为好，因为在组织固定过程中，可防止固定液挥发，标本固定后易于取出。遇传染性标本（结核）应注意勿污染容器的外表；标本容器上要另贴患者姓名、性别、年龄、标本名称或送检单联号的标签号码。如果同一患者从多处不同部位切除的标本，应分瓶盛装，并在瓶上分别注明。不同患者的标本不能放在同一患者的标本容器内，以免混乱、污染造成误诊；2.切取小块组织作检查时，切勿用有钩镊子夹取、挤压和牵拉，否则会引起人为的变态，无法作出确诊；3.体液标本找癌细胞，要求越新鲜越好，因此，收集后必须立即送检制作固定，各种体液标本收集方法如下：（1）痰液，采取自咳痰的方式，以收集晨痰为主。患者于早晨起床后，咳痰前先用开水漱口，清除口腔、鼻腔内的分泌物，然后开始咳痰，要收集确定是从肺深部咳出的痰为好。住院或门诊的患者，前者可由临床医师指导其咳痰，后者可由临床医师向其家属说明咳痰方法后由家属指导收集痰液，并立即送检；（2）浆膜腔积液（胸水、腹水、心包液等），抽取后立即注入含有抗凝剂（粉沫）的玻璃试管内（用一般生化检验的抗凝管即可）5ml摇匀，或在积液中加入3.8%枸椽酸钠水溶液抗凝（抗凝剂与积液的比例是1:9或2:8之间），立即送检；（3）尿液，以自排尿方法收集早上第一次全尿，不加任何防腐剂，立即送检；（4）胃液，抽送空腹胃液；（5）鼻咽，阴道、食道拉网和肿物穿剌等脱落细胞标本由临床医师采集涂片固定后送检。应注意涂片制成后切勿干燥立即投入固定液固定；4.标本送检前先填好标本送检申请单，按申请单中规定的项目详细填写清楚，包括患者的永久地址；5.速诊活检，预计在手术进行中须作活检速诊时，可在手术前一天与本室联系，以便作好准备，如果在手术过程中遇到特殊情况需要病理医师临场时，可电话通知本室立即前往；6.外地活体标本，应妥善盛装后将标本容器密封包装，以免邮寄途中破损。玻片标本可用硬纸皮制成与盖玻片大小相仿的纸夹，将盖玻片标本夹好封妥用平信邮寄即可。 【 标本收检 】1.收检标本时，必须详细查对标本与送检单所署的标本名称、患者姓名或送检单联号的标签号号码是否相符，若发现有错漏或疑问时立即与临床有关医师联系，尽可能做到及时处理；2.检查标本容器内是否加足了固定液，如固定液太少时及时补充。检查使用的固定液是否恰当，否则应及时更换固定液，如果的确无法补救时，应在送检单背面记录栏说明；3.收检标本按活检、体液二类分别编号登记。 【 活体组织取材】1.标本收集后，首先进行编号登记；2.标本取材前，应先校对送检标本瓶上的标签号码、患者姓名以及标本性质、瓶数与送检单所描述的是否相符，然后才开始取材；3.检查标本，观察其大小形态、色泽、硬度及肉眼病理改变并进行描述。检查病变部位应按诊断的实际要求取材，组织块厚度不超过0.3cm，大小在2222mm范围内，放入用铅笔写好号码的组织脱水盒内，每合原则上放一块（小块组织例外），如放入两块以上者，应在组织脱水盒上号码后注明A、B、C字样，以便区分；4.芝麻或帽针头大的组织，必须用擦镜纸包裹，色泽灰白色者应加染伊红，以免在制作过程中失落；5.标本必须全埋者，在送检单上注明全埋字样。皮肤，囊壁或管状组织必须企埋者亦在送检单上注明企埋字样；6.骨及钙化组织应行脱钙处理，取材时要用骨锯忌用凿子，组织块厚度通常不超过0.5cm，并向技术室当班者交待清楚；7.取材完毕，肉眼标本应按顺序排列归档、保留壹周，如需要继续保存者，通知技术室保存；8.凡重切重埋或加特殊染色项目的标本，应书面通知技术室当班者；9.取材完毕，工具在稀来苏溶液中消毒30min，取出用肥皂水洗，然后以自来冲洗、擦干，必要时抹上防锈油，以便下次使用。肿 瘤 【 观 察 】 注意肿瘤的部位，形态、大小、颜色以及与周围组织关系，有无完整或不完整的包膜，测量肿瘤的体积，包括长度、阔度、高度（厘米），实质性肿瘤量直径，浅表部的肿瘤应注意其与皮肤的关系，是否凸出皮面，与皮肤有无粘连，四周有无正常的皮肤组织。 【 扪 诊 】 注意肿瘤的质地（硬实、中等、软）各处的坚实度是否一致，有无与周围组织粘连的情况。 【 切 面 】1.方法：切面应暴露肿瘤的最大面积，以便较全面观察肿瘤内部，巨型肿瘤应多作平行切面；2.观察：注意肿瘤切面的形状，大小和颜色，在结构上是否均匀一致，有无出血坏死，有无包膜，有无浸润；3.包埋组织块的选择：根据肿瘤的大小决定包埋组织的块数，原则上选择：（1）肿瘤中央；（2）肿瘤边缘与瘤外组织相连部份，包括瘤外组织；（3）肉眼所见的不同性状的各部份；（4）所有淋巴结作包埋。常见肿瘤和器官的取材常规 【 食道癌 】1.肿瘤中央；2.肿瘤边缘；3.食道旁淋巴结组织；4.手术标本切缘。 【 胃 癌 】1.溃疡型者取材包括溃疡中央及溃疡边缘并直达浆膜；2.大小网膜淋巴结；3.正常胃壁；4.手术标本切缘。 【 结肠癌 】1.取肿瘤中央；2.肿瘤边缘；3.周围淋巴结；4.标本外科切缘。 【 宫颈原位癌 】1.宫颈按12点钟位置切12切；2.全宫切除者取宫壁组织1块（从宫内膜至浆膜 ）。 【 子宫体癌 】1.肿瘤中心直达宫壁浆膜，因组织块太大可在肌层分成2块；2.肿瘤边缘包括正常宫内膜相连接的部分；3.宫颈组织1块；4.有双侧附件者，均取组织进行检查；5.区域淋巴结（根治术清扫）若临床分瓶送检者均应取材包埋，宫旁组织、阴道穹窿需取材检查。 【 乳腺癌 】1.肿物中心；2.肿物基底部；3.与皮肤相连的部分；4.乳头部；5.乳腺深部淋巴结；6.腋窝淋巴结（乳腺深部淋巴结一般不多，应全部取材，腋窝淋巴结可有选择地取材）。 【 肝 癌 】1.肿物中心；2.肿物边缘；3.远处肝组织1块，（淋巴结一般由外科分别标明部位分瓶盛装送检，应全部取材包埋）。 【 甲状腺肿瘤 】1.肿物中心；2.包膜及包膜外的正常甲状腺组织（甲状腺肿瘤必须注明有无包膜及包膜是否完整，若为一般腺瘤，可在包膜两侧包括肿物与肿物外围正常甲状腺组织共取1块即可）。肿物有囊性变者可再取囊壁1块，若为癌者要在疑有包膜侵润部位多取组织块；3.有淋巴结应全数取材包埋。 【 骨肿瘤 】1.肿瘤实质部分带骨和不带骨的组织尽量分别取材包埋（肿瘤实质部分尽可能取2块以上组织）；2.肿瘤边缘部分（包括骨质）；3.肿瘤外围组织。 【 脑肿瘤 】 原则上就包括肿瘤本身，肿瘤和瘤处相连组织。 【 肾肿瘤 】1.肿瘤在肾盂部位者应取肿瘤中心及肿瘤与肾实质相连部位组织包埋；2.有输尿管相关者应注意输尿管内膜情况并切取组织一块，以切取病变的狭窄或扩张为原则，并注意；（1）中心部分；（2）向肾包膜及与包膜外相邻组织部位；（3）与肾盂相连部位；（4）有出血坏死者应切一块包括无出血坏死及出血坏死部位；（5）肾外组织；（6）输尿管；（7）有淋巴结者应全数取材。 【 胃溃疡 】1.测量胃的长度及宽度；2.沿胃大弯剪开；3.标示溃疡部位，测量溃疡的直径；4.若未见溃疡则应注意幽门偏外科切口粘膜下层有无粘连，肌层有无增厚及有无疤痕形成，原则上应切取这些有改变的部位；5.溃疡有无穿孔，溃疡的取材应通过溃疡中心，并直达浆膜层。 【 子宫肌瘤 】1.肌瘤中心；2.肌瘤边缘（小者取1块即可，其中包括肿瘤中心及边缘与正常子宫肌相连部位）；3.子宫内膜和宫壁；4.宫颈；5.如为多发性子宫肌瘤应记录数目及最大肿物与最小肿物的直径，取材应取2块肿物为原则；6.若肿物切面编织状条纹结构模糊或消失，质地变软或呈鱼肉样外观者，则该肿物应多处取材。 【 输卵管 】1.输卵管积水（1）测量输卵管长度及膨大积水部之直径；（2）作纵行切开，注意检查囊肿是否与输卵管相通，并作好记录；（3）囊壁部取2块，近端输卵管横断面取1块。2.输卵管妊娠（1）测量输卵管长度及膨部直径；（2）检查有无破裂出血，管壁侧有无血块附着；（3）沿纵轴剪开；（4）包埋组织选择，应选取血块中包含有灰红色绒毛样组织，另外在血块与管壁相连部有选择地切取1块，胎盘绒毛常在血块中才能找到，故应注意检查血块的情况，在怀疑有绒毛处多取几块。 【 卵巢囊肿 】1.临床提示卵巢朱古力囊肿者，应注意囊肿内是否含咖啡色液体，囊肿外侧卵巢表面是否粗糙，囊肿的大小均应作好记录。选取囊壁组织2块，1块向卵巢表面，1块向卵巢深部；2.囊肿内含皮脂毛发及牙齿等，常规记录囊肿直径及囊内内容物性质。包埋组织块的选择原则凡囊内实性部位应取12块，牙齿和骨一般不取，但应作好记录；3.囊肿为多房性，囊内含假粘液块状物或稀粘液样内容物者，常规作好囊肿大小及囊外形状，内容物的记录。其中包括囊壁厚薄度的记录，尤其注意有无实性部分、实性部分的色泽、硬度、有无出血坏死。取材原则：（1）实性部位有选择地取2块以上；（2）最厚囊壁部位取2块；（3）最薄囊壁部位取1块；4.囊肿为单房性的，囊内含清黄色液体并见囊壁有乳头形成者，应注意囊肿表面是否也有乳头生长，作好记录。卵巢浆液性乳头状囊腺瘤有时仅有单个极细的小乳头，应仔细检查，并在乳头形成和无乳头形成的囊肿壁取材共2块；乳头形成较广泛而且体积较大较实者，应切开观察切面有选择地切取2块以上，同时注意有无砂粒体，必要时先行脱钙处理。 【 卵巢实性肿瘤 】 同肿瘤取材。 【 阑 尾 】1.记录阑尾长度、直径及外表的状态，注意有无穿孔、恶臭；2.在病变较明显或穿孔部位取材，一般作横切面取12块；3.慢性阑尾炎在距阑尾末端1.5公分附近及有病变处取材。镜观检查1.镜观检查前应该对切片号码，标本种类；仔细阅读病史和眼观检查记录。2.要将切片全部检查到，以免漏诊。若曾做过与此次有关的病理检查，应与旧片做对比。观察完毕后要提出切片质量的意见。3.诊断时密切结合临床，必要时与经治医师联系。当镜下所见与临床诊断有重大出入时，更要慎重，并须检查制片过程有无错误。4.活体组织的急诊检查时，应以最快速度做出确实诊断，诊断有困难时，不勉强下结论，应多做切片观察，并与临床医师联系，提供检查情况，以便考虑进一步处理。5.病变描写要真实、客观、有条理，简明扼要地说明诊断依据。诊断应经负责医师复核签署，方可发出报告。6.疑难病例应展开讨论，必要时邀请有关单位会诊。（ 王晓玫 徐胜美 ）第二节 制片工作常规自动组织处理机的使用和维护 【 机器使用 】 应熟悉机器说明书中的使用说明及注意事项1.检查升降机械部分是否正常；校正各试剂罐的位置，使标本篮升降时正好落入罐内；检查恒温电源插头是否对号插入插座；有恒温水箱者，检查箱内水位；2.按选定的脱水方案调整好时间控制装置，用表盘控制者，按方案剪好缺口，并装于机上；用旋钮控制时间者，按方案拔各调节旋钮到指定位置；3.向试剂罐内注入各脱水剂等试剂。使用过程中试剂挥发较多，应注意及时添加；4.合上电源开关，加热蜡罐和恒温水箱，使达预期温度；5.将标本篮挂升降伞的挂钩上，放入第一个脱水剂中，按机器设计的启动顺序，使机器开始工作；6.有延时装置者，于需重延时工作时，按延时装置使用要求使用；7.当完成最后一道程序后，应及时取出标本包埋，并随时关闭机器；8.使用注意事项及维护：（1）机器应放于清洁、通风、平稳处；（2）应经常注意机器运转是否正常，时间控制及温度控制是否准确，恒温水箱水位是否足够；（3）应经常做好清洁除尘工作，并向机械部分加润滑油此时应注意切断电源，以保安全。 【 组织处理机脱水程序和时间 】1.10%福尔马林 11小时；2.85%乙醇 30分钟；3.95%乙醇 30分钟；4.95%乙醇 30分钟；5.无水乙醇 30分钟；6.无水乙醇 30分钟；7.无水乙醇 30分钟；8.丙酮 20分钟；9.二甲苯 20分钟；10.二甲苯 20分钟；11.石蜡 30分钟；12.石蜡 30分钟。石蜡包埋1.包埋时先将融蜡倾入模型，然后以钝头热镊夹取组织块，使病灶或指定面向下（包埋分层次的组织在蜡中安放平正。注意防止混杂组织碎屑；2.组织埋入蜡块中以后，即将该组织的号码小条埋入蜡块一侧；3.蜡稍凝后，即移入冷水中加速凝固；4.蜡块的大小，以在组织周围包有12mm之蜡为宜。蜡块做成正方形或长0方形，以便切片。石蜡切片法1.将切片刀装在持刀座上，刀刃与蜡块表面呈50夹角。调整后勿任意变动；2.将蜡块固定于持蜡器上，并调整蜡块与刀至适当位置；3.移动刀座或持蜡器，使蜡块与刀刃接触，旋紧刀座；4.以右手匀速旋转机轮，到组织已全部切出，或所需的部分已切出。微小组织应注意勿修切过多。调节厚薄器到46um，继续切片，除特殊要求者，一般勿切过厚；5.以小镊取完整无划痕、厚薄均匀的切片，将其放入温水中，使展平无折，每一蜡块多切数个切面，选择较好的切片裱于载玻片上。需要多个不同水平切面时，应多选切片。水浴温度以低于蜡熔点1012上下为宜；6.裱片时使切片玻片之间无气泡，切片的位置应端正，裱成后随即在玻片上写上号码；7.将切片放在烘片板或温箱中烘干；8.有特殊要求者应按要求切片。冰冻切片恒冷箱切片机（Cryostat）切片1.熟悉机器说明书，了解机器的特点、性能和操作方法等；2.接通电源装好切片刀，关闭观察窗，合上降温开关，调整温度控制器到所需温度（一般为25左右）；3.箱内温度下降后，打开观察窗，将组织固着器放于箱内速冻台上，先放少量OCT或羧甲基纤维于其上，冻结后将组织块放上，并在其周围加适当包埋剂，使组织包于其中；4.组织冻结后，将组织固着器装于切片机上，调整组织的切面，使与刀刃平行，并使贴近刀刃，调整切下厚度指示装置，至所需刻度，关闭观察窗；5.切片时先修整组织表面，再放下抗卷板切取薄片，并将切片贴于清洁盖片或载片上；6.取出切片，吹干或固定处理；7.切片完毕拔回温度控制器，切断电源。待箱内温度回升后，擦干箱内各装置并上油，若经常使用，可不拉开电源开关，不用时使箱内温度保持在0。（ 刘东广 苏学劲 ）脱落细胞学标本制片 【 取材和制片 】1.痰：标本必须新鲜，咯痰前应先漱口，要求患者从呼吸道深部咯出，痰中不应含食物碎渣和唾液。必要时指导患者咯痰，或到病区直接收取。挑取标本，应选择痰中坏死组织、带血痰外周的粘液等，作成厚薄均匀的涂片24张；2.浆膜腔抽出液：标本应于抽出后30min内送检。收到标本后应即以2000r/min离心510min，取沉淀物作均匀涂片24张。如标本中细胞太少，可用红细胞比容管将第一次沉淀物，再以300r/min离心30min，吸取中层液涂片；含大量血液的标本，离心后取红细胞上层的白细胞层做涂片。标本为脓性无法离心时，可直接做推片。标本如已凝固，即不适用，应予重抽，改用抗凝管装盛；3.尿：收集新鲜晨尿，不少于50ml，10002000r/min离心510min，取沉淀做涂片。个别尿中有胶冻状物，应先除去。方法为：用0.5mol/L盐酸或0.5mol/L氢氧化钠调节尿pH至6.0，经离心后加95%乙醇510ml于沉淀物中，静置5min，固定细胞，然后加蒸馏水，轻轻摇匀溶解冻状物，离心，取沉淀物涂片；4.胃液、胃冲洗液：将全部标本以3000r/min离心1020min，取沉淀物涂片24张；5.脑脊液：新鲜标本以2000r/min离心1015min，取沉淀物涂片。脑脊液中细胞较少，离心后尽量倒出全部上清液，后取沉淀物；6.食管、胃拉网管采集的标本，阴道排出物，子宫颈括片及其它分泌物标本，由临床医师做成涂片，固定后送检；7.淋巴结及各种肿块穿刺，将抽吸物做涂片；有小组织者，同时做切片检查，唇、舌、龈、颊粘膜、鼻腔、鼻咽、扁挑体、眼结膜、外耳道、皮肤溃疡等浅表部位病变，除作活检外，可作直接涂片检查；8.内镜细胞刷采集的标本，可作直接涂片，或细胞刷洗液沉淀作涂片。其它穿剌液，冲洗液等标本，离心后取沉淀物涂片；9.如有大量沉淀物，可于涂片制成后，将剩余部分，以拭镜纸包裹，按蜡切片法，经脱水等处理作蜡切片检查； 【 固定与取材 】1.可选用乙醚-乙醇（乙醚50ml,95%乙醇50ml，冰醋酸1ml），氯仿-乙醇（氯仿30ml，无水乙醇60ml，冰醋酸10ml）或含3%醋酸的95%乙醇为固定液；2.涂片制成后立即浸于固定液中（切勿待干燥后才固定），固定液应浸没整个涂片，固定时间不得少于15min。含粘液较多的标本，应适当延长固定时间，亦可将涂片平放于架上滴加固定液固定；3.涂片上应有编号，每号标本分放单独容器，以免混淆；4.固定液每次用后，应经过滤并添加适量新液才能再用，必要时更换新液。容器亦须冲洗干净。（ 王 玲 ）第三节 染色常规一般常规1.切片脱蜡应彻底，室温较低时更应注意，以切片在二甲苯中呈透明状，或移入乙醇后，片上无白色斑点为佳；2.特殊染色、组织化学反应，按各方法的要求进行组织固定处理，以保证效果。对酶反应更应严格要求。凡用含升汞固定液固定的组织，于切片脱蜡后，应经脱汞处理，方可染色。其法为：切片经水洗2min，浸于0.5%碘酊溶液中10min，水洗；0.5%硫代硫酸钠水溶5min，用水彻底冲洗；经蒸馏水洗后染色。在脱汞过程中，慎防切片脱落；3.各种染料试剂一般选用化学纯。各种染料着色效果常因生产厂和批号不同而异，启用任何新品，均应先试染。配成的染液、试液应盛于有色试剂瓶内，瓶签应写明名称、含量、配制年月日，顺序保存于避光橱中，必要者放冰箱内。凡须临用时配制者，配量应适当；4.染色各步骤所需的时间，常受温度、切片厚度等影响。可根据镜下观察所见酌予调整，但对组织化学反应（尤其是酶），其时间、温度等因素务必恒定，且应做对照片。染液着色力显著减退时应更新，染色反应不正常，应检查染液及试剂是否失效或误用；5.染色过程中，勿使切片干燥，以免影响细胞状态。染色完毕后用显微镜检查染色结果，是否符合要求，并核对标本种类、号码、数量是否无误；6.火棉胶切片除可做常规染色外，尚可做常用特殊染色及PAS、DNA、RNA等主要组织化学染色。卡红（Carmine）使火棉胶着色，含此染料的染色效果不佳。苏木紫-伊红染色法染液配制 【 能苏木紫染液的配制 】 实验室常用的苏木紫液有多种，以下为有代表性的数种，可根据各单位具体情况选用。1.哈里新（Harris）苏木紫液：甲液：苏木紫Ig，无水乙醇10ml。乙液：硫酸铝钾（或铵）20g，蒸馏水200ml，加温溶解。甲、乙二液分别溶解后混合，加热煮佛，沸后去火，待溶液不翻腾时即加入氧化汞0.5g（此时有大量气泡生成，故容器宜大，以免液体溢出）。然后染液迅速冷却，冷却后过滤，即可位应用。用时每100ml加冰醋酸4ml；2.迈尔（Mayer）苏木紫液：将苏木柴0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜，即可应用。染色时间约1020min；3.欧立区（Ehrlich）苏木紫：将苏木紫2g溶于无水乙醇100ml中；将硫酸铝钾15g溶于蒸馏水100ml中，加入甘油100ml，将二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混匀后，盛于无色小口瓶内，暴露于日光下，使其自然成熟，约需3个月。染色时间约520min。此液贮存愈久，染色力愈强。若在其中加入碘酸钠300mg，使人工成熟，配成后即可应用；4.卡拉兹（Carrazzi）苏木紫：将苏木紫0.5g溶解于甘油100ml中，将硫酸铝钾25g溶解于蒸馏水350ml中溶解后将二液慢慢混合，并充分摇匀。将碘化钾0.1g放于蒸馏水50ml中，加微温溶解，然后加入苏木紫液中，充分摇匀，翌日可用。 【 伊红液配制 】 伊红1g，蒸馏水5ml。溶解后滴冰醋酸于期中，有沉淀生成，至成浆糊状再加入水数毫升，并继续滴冰醋酸，直至沉不再增加，过滤，弃滤液留沉淀物，待其干燥后，溶于95%乙醇200ml即成。石蜡切片染色法1.二甲苯去蜡（经二次）510min；2.无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各12min，然后蒸馏水洗3min（换数次）；3.苏木紫液染色约5min（视染液种类和着色情况增减）；4.水洗；1%酸性乙醇（盐酸1ml、70%乙醇99ml），或1%盐酸分化。显策微镜下控制；5.流水浸洗至少15min，至细胞核呈蓝色，也可短时水洗后，浸于40温水使核变蓝。显微镜观察，若核染色过深或不足，应再分化或重染；6.伊红液染12min后，95%乙醇二次，无水乙醇二次，每次约12min；7.苯酚二甲苯（1:4）1分钟；8.二甲苯二次,每次1分钟；9.用中性树胶或DPX以盖片封片，贴标签。冰冻切片染色法1.冰冻切片用贴片，入蒸馏水稍洗数秒；2.哈里斯苏木紫染1/21min，水洗，必要时1%盐酸分化；3.在约40温水中浸至切片呈蓝色（约数秒）；4.5%伊红乙醇溶液染1020s；5.95%乙醇，无水乙醇脱水各数秒，二甲苯透明、封片。 【细胞学标本染色法】1.苏木紫-伊红染色法，参见前节石蜡切片染色；2.巴氏染色法。 【染色法 】1.已固定的涂片流水洗2min，蒸馏水洗1min；2.哈里斯苏木紫染35min，水洗1min；3.0.5%盐酸分化至细胞核染色清晰，水洗，并浸于水中至核变蓝；4.5%、80%、95%的乙醇各1/21min；5.桔黄G6染色4min；6.95%乙醇洗二次，每次各1/21min；7.EA36染色810min；8.95%乙醇洗二次，每次各1/21min；9.无水乙醇浸洗二次，每次各1min；10.苯酚二甲苯浸洗23min，二甲苯23min.中性树胶封片。（ 苏学劲 刘东广 ）第四节 常用特殊染色及组织化学技术结缔组织及肌肉组织的鉴别染色 范基林(Van Gieson)法 【 结 果 】 细胞核紫褐色，胶原纤维红色，平滑肌纤维和神经胶质呈黄色。 海登海因(Heidenhain)偶氮卡红苯胺蓝法(简称Azan法) 【 结 果 】 细胞核深红色，胞浆粉红色，胶原纤维蓝色，肌纤维红色或桔黄色，神经胶质红色，粘液，类胶质蓝色，腺体胞浆颗粒依其性质不同而呈红、蓝或黄色。 改良马逊(Masson)三色染色 【 结 果 】 胶原纤维绿色，肾小球基底膜炎绿色，平滑肌、纤维素和纤维素样物桔红色，细胞核棕色。 【 注 意 点 】 （1） 此法广泛用于胶原纤维和平滑肌的鉴别，也为肾组织活检，观察肾小球病变的重要染色法，常用于观察缺血病变的心肌。 用于观察肾小球病变时，一定要用2um以下半薄切片。 （2） 细胞核染色后分化很重要，观察控制着色程度。 网状纤维染色 （1） 富特(Foot)镀银法 【 结 果 】 网状纤维呈黑色。 （2） 戈登史威特(Gordon&Sweet)法 【 结 果 】 网状纤维呈黑色。 横纹肌组织染色 马洛里(Mallory)磷钨酸苏木紫法(参见神经组织染色节)。 梗死心肌的鉴别染色法 【 结 果 】 正常心肌绿色，梗死心肌紫红色。脂质染色 猩红染色法 【 结 果 】 细胞核呈蓝色，脂肪呈鲜桔红色。 【 注 意 点 】 猩红染液易挥发，容器应盖紧。切片自猩红染液中取出后，应迅速洗涤，以免沉渣残留而混淆结果。 油红O染色法* 【 结 果 】 脂质红色，细胞核蓝色。 若用苏丹黑B代替油红O，脂质显黑色，方法相同。 染磷脂的Baker酸性苏木因法 【 结 果 】 磷脂暗蓝色。 【 注 意 点 】 此法核蛋白与脑苷脂均可染呈暗蓝色。应同时作一阴性对照片，对照片先用氯仿甲醇(2:1)提取，再进行染色。碳水化合物和淀粉样物 希夫过碘酸(PAS)染色法 【 结 果 】 阳性物质(如含糖原或中性多糖等物质)呈红色。 酸性粘多糖的阿尔新蓝(Alcian blue)法 （1） 阿尔新蓝pH2.5染色法(AB pH2.5) 【 结 果 】 酸性粘液(唾液酸粘液)呈鲜蓝绿色，细胞核红色。 （2） 阿尔新蓝pH1.0染色法(AB pH1.0) 【 结 果 】 硫酸化粘液呈蓝绿色，细胞核红色。 阿尔新蓝-PAS法(AB/PAS)* 【 结 果 】 酸性粘多糖呈蓝色，中性多糖呈紫红色，含此二成分复合物时呈红蓝不同反应。真菌体、球菌粘性液夹膜、肥大细胞颗粒等均可显不同反应。 *通常用pH2.5的阿尔新蓝。为鉴别酸性粘多糖的类型，需采用不同PH的阿尔新蓝染液。 显示硫酸化粘多糖的高铁二胺法(HID法) 【 结 果 】 硫酸化粘多糖呈棕黑色。若用AB或AB/PAS复染，则唾液酸粘多糖蓝色，中性粘多糖红色。 过碘酸硼氢化物氢氧化钾过碘酸希夫反应(简称PB/KOH/PAS) 【 结 果 】 阳性反应物(O-乙酰唾液酸粘液)红色。对照片不经氢氧化钾处理，仅作PB/PAS，结果应为阴性。 迈尔Mayer粘液染色法 【 结 果 】 胞核蓝色，粘液呈红色。 淀粉样物染色法 （1） 碱性刚果红法 【 结 果 】 细胞核蓝色；淀粉样物粉红到红色，在偏光镜下见苹果绿色双折光。切片用无荧光性封固剂封片，在荧光显微镜下见桔黄到红色荧光。 （2）甲紫法 【 结 果 】 类淀粉物呈紫红色，其它结构呈紫或蓝色。核酸染色 费根(Feulgen)反应 【 结 果 】 脱氧核糖核酸红色，细胞浆绿色。 显示RNA和DNA的甲基绿（Methyl green）焦宁（Pyronin Y）法 组织须经卡诺伊（Carnoy）液或中性福马林固定，蜡切片或冰冻切片。 【 结 果 】 核染色质(DNA)呈鲜明绿色或蓝绿色，核仁及胞浆（RNA）呈鲜红色。 色素和无机物 黑色素染色法(丰塔纳Fantana法) 【 结 果 】 黑色素颗粒呈黑色，核红色。 显示多巴氧化酶(酪氨酸酶)法 【 结 果 】 酪氨酸酶活性处呈黑色，胞核红色。 含铁血黄素的证明(珀尔斯，Perls)法 【 结 果 】 (正)铁呈深普鲁士蓝色，核呈红色。 证明胆红素的Hall法 【 结 果 】 胆红素显翠绿色，胞核红色。 脂褐素(lipofuscin)的显示 显示脂褐素的Schmorl反应 【 结 果 】 脂褐素蓝到暗蓝色；黑色素暗蓝色；嗜铬颗粒绿蓝色；亲银颗粒蓝色；SH基蓝色；细胞核红色。 【 注 意 点 】 由于一般组织中有少量还原剂，背景很快着色，因此染 色应用最短时间。切片在试剂内30s后就应在镜下观察是否已显色。多数情况下，脂褐素和黑色素在2min内着色，嗜铬颗粒等需时稍长。 为显示嗜铬颗粒，必须用含铬盐固定液固定组织。显示亲银颗粒，必须用福尔马林生理盐水固定组织。 组织内二价铁会产生假阳性。 钙盐的证明冯库萨(Von Kossa)法 【 结 果 】 钙盐呈黑，核红色。 （ 李 红 刘东广 ）内分泌腺细胞、产肽细胞(APUD)染色 显示胰岛细胞的改良醛品红(Aldehyde fuchsin)染色 【 结 果 】 胰岛B细胞紫红色，A细胞黄色，D细胞绿色。胶原 纤维绿色，弹性纤维和硫酸化粘多糖紫红色。此外垂体颗粒，肥大细胞颗粒，胃主细胞颗粒也被此法着色。 Grimelius胰岛A细胞，嗜银细胞染色 【 结 果 】 胰岛A细胞，嗜银细胞等棕黑色。 垂体前叶细胞PAS-桔黄G染色法 【 结 果 】 嗜碱性细胞红色，嗜酸性细胞、红细胞黄色，嫌色细胞淡灰蓝色，细胞核蓝色。 嗜铬细胞染色法 【 固 定 】 组织需用含重铬酸盐固定液固定。福尔马林固定组织将失去嗜铬性。 改良姬姆萨（Giemsa）染色法 【 结 果 】 嗜铬细胞颗粒染为绿黄色，其它胞浆呈粉红红色，细胞核蓝色。 Ogata-Ogata银浸染法 【 结 果 】 嗜铬细胞颗粒呈黑色。 显示亲银细胞（Argentffin cell）颗粒的碱性重氮反应 【 结 果 】 亲银细胞颗粒桔红色，细胞核蓝色。 【 注意点 】 （1） 标本应尽早固定，尸检标本效果常不好。 （2） 用已知对照片。某些类癌结果为弱阳性。阑尾和小肠的肿瘤通常为阳性；支气管类癌几乎都呈阴性。神经组织染色 Gless-Marsland神经纤维染色 【 结 果 】 神经纤维黑色。 神经细胞尼氏小体染色法甲苯胺蓝法 【 结 果 】 细胞核淡蓝色，尼氏小体深蓝色，背影无色。 神经髓鞘色法外耳(Weil)法 【 结 果 】 髓鞘呈蓝黑色。 Luxol固蓝(Luxol fast blue)染色 【 结 果 】 髓鞘蓝色。PAS复染则阳性物红色；焦油紫复染则尼氏小体紫色。 神经胶质及肌胶质染色法马洛里(Mallory)磷钨酸苏木紫法 组织需经秦克液固定。福马林固定的组织切片，可经秦克液处理数小时，否则效果欠佳。 【 结 果 】 神经胶质、肌胶质、纤维胶质、纤维蛋白、横纹肌的横纹等呈蓝色，胶原、网状纤维、骨基质等呈黄色至砖红色，粗弹性纤维呈紫蓝色。 Cajal星形细胞染色 【 结 果 】 星形细胞呈深紫黑色；背影灰紫或灰红色。微生物染色 革兰细菌染色法 麦卡伦(Aac Callum)修订文古氏(Goodpasture)法。 【 结 果 】 革兰阳性细菌深紫色；阴性菌呈红色。胞核深红色，胞浆浅红色。 耐酸细菌染色法： （）齐尼二氏(Ziehl-Neelsen)改良法。 【 结 果 】 耐酸菌红色，细胞核等蓝色。 （）韦德菲(Wade Fite)法。 【 结 果 】 耐酸细菌红色，细胞核紫蓝色。此法染麻风杆菌尤佳。 真菌染色： （1） PAS染色法。 （2） Gridley法。 【 结 果 】 真菌孢子深红色，菌丝蓝色，背影依复染液而异。 （3） 六次甲基四胺银染色。 【 结 果 】 真菌和一些细菌呈黑色。 螺旋体、军团病杆菌(Legionnaires disease bacteria)染色 （1） 石蜡切片中螺旋体和军团病杆菌改良的Dieterle浸银法。 【 结 果 】 螺旋体和军团病菌呈黑色。 （） 军团病杆菌的Gimenez染色法。 【 结 果 】 军团病杆菌红色，背景绿色。 乙型肝炎表面抗原染色地衣红(Orcein)法 【 结 果 】 肝炎表面抗原染暗棕色到紫棕色，定位于胞浆，弹性纤维也被地衣红着色。 乙型肝炎表面抗原染色维多利亚蓝(Victoria blue)法 【 结 果 】 乙型肝炎表面抗原蓝色，细胞核红色，弹性纤维蓝色。其它染色法 六次甲基四胺银(Methenamine silver)染色法 【 结 果 】 基底膜、真菌、粘液和一些细菌染呈黑色。 尿酸盐结晶的显示 【 结 果 】 尿酸盐结晶呈棕黄色放射状，细胞核蓝色。显示酶的组织化学法 显示碱性磷酸酶的钙钴法 【 结 果 】 碱性磷酸酶活性处呈黑色或棕黑色 冰冻切片法：1015um冰冻切片贴于清洁玻片，室温晾干12h。于培育液中371/24h，其余步骤同上。 显示碱性磷酸酶的萘酯磷酸法 【 结 果 】 碱性磷酸酶活性处呈暗蓝色。 显示酸性磷酸酶的硝酸铅法 【 结 果 】 酸性磷酸酶活性处呈黑色。 过氧化酶反应 【 结 果 】 过氧化酶颗料呈蓝色，细胞核红色。 显示三磷酸腺苷酶铅法 【 结 果 】 三磷酸腺苷酶活性处呈棕黑色。 显示非特异性酯酶的六偶氨副品红醋酸萘酯法【 结 果 】 非特异性酯酶活性处呈棕红色颗粒状，定位于胞浆，细胞核绿色。 【 注 意 点 】 培育液配好后很快失效，须事先做好切片入培育液的准备，培育液配好后，立即将切片放入。 显示琥珀酸脱氢酶的硝基四氮蓝(Nitro-BT)法 【 结 果 】 琥珀酸脱氢酶活性处呈蓝色。（ 庞春平 王 玲 ）第五节 免疫组织化学技术 一般常规 免疫组织化学的标本，应于标本取出后及时处理。使用石蜡切片的标本，及时固定于所需的固定液中，按要求的程序室温脱水，包埋。用冰冻切片的标本，应及时用恒冷箱切片机切片。若当时不能进行切片，可切取适当大小的组织块，放锡纸上，周围包以OCT或羧甲基纤维素，将锡纸包好，放液氮或干冰丙酮中速冻保存，也可放7080低温冰箱中保存备用。 免疫酶反应的切片，反应前应封闭内源酶活性。方法是将切片于脱蜡后，浸于新配的0.5过氧化氢甲醇液(3过氧化氢1份，甲醇5份)，室温3060min。 为了消除背影的非特异着色，可用动物正常血清，覆盖切片37 30min。 做免疫酶或免疫荧光反应所用的各种抗体，均应事前经预试验，求得适当稀释度，并尽可能采用高稀释度(尤其是第一抗体)。稀释后的抗体限当时应用。所有抗体均应保存于冰箱中，在有效期内使用，避免反复冻融。 在分次进行同一实验时，应保持条件一致。每次均应同时作阳性和阴性对照。 免疫荧光的切片，用无荧光性封固剂封片，及时观察，摄影记录。 使用单克隆抗体进行免疫反应，标本制备、反应染色等与用其它抗体的方法相同。免疫酶技术 直接法 （1） 石蜡切片常规脱蜡至水；冰冻切片贴于玻片后，电扇吹干。 （2） 将切片浸于新配的0.5过氧化氢甲醇液，室温30min，封闭内源过氧化物酶活性。 （3） 蒸馏水、PBS洗3次，每次5min。 （4） 正常动物血清(适当稀释)培育切片，湿盒内37 30min。 （5） 用纸吸干多余血清。 （6） 过氧化物酶标记的抗体(适当稀释)培育切片，湿盒内373060min，或4过夜。 （7） PBS洗3次，每次5min。 （8） 切片浸入新配的底物显色310min(DAB)。 （9） 清水冲洗。 （10） 苏木素复染细胞核。 （11） 脱水、透明、封片。 【 结 果 】 阳性反应部位呈棕黄色，细胞核淡蓝色。 间接法 （1）（5）同直接法 （6）第一抗体覆盖切片，放湿盒内，3730min。 （7）PBS洗3次，每次5min。 （8）过氧化物酶标记的第二抗体培育切片，湿盒内3730min。 （9）PBS洗3次，每次5min。 （10）切片入新配的底物显色(同直接法)。 （11）清水冲洗。 （12）苏木素复染细胞核。 （13）脱水、透明、封片。 【 结 果 】 阳性反应部位呈棕黄色，细胞核淡蓝色。 辣根过氧化物酶抗辣根过氧化物酶(PAP)法 （1）（5）同直接法。 （6） 第一抗体覆盖切片，放湿盒内。37 3060min。或于37培育后，再于4过夜。 （7） PBS洗3次，每次5min。 （8） 第二抗体覆盖切片，放湿盒内。37 30min。 （9） PBS洗3次，每次5min。 （10） PAP复合物覆盖切片，放湿盒内，37 30min。 （11） PBS洗3次，每5min。0.05mol/L Tris-HCL缓冲液洗5min。 （12） 切片入新配的底物显色(同直接法)。 （13） 清水冲洗。 （14） 苏木素复染细胞核。 （15） 脱水、透明、封片。 【 结 果 】 阳性反应部位呈棕黄色，细胞核淡蓝色。 注：双桥PAP法为：实验进行到(10)后，再重复(7)(10)一次 ，然后继续完成，但应过夜。 葡萄球菌A蛋白(SPA)免疫酶法 （1）（5）同直接法。 （6） 第一抗体培育切片，放湿盒内，37 3060min。 （7） PBS洗3次，每次5min。 （8） 酶联SPA培育切片，湿盒内3730min。 （9） PBS洗3次，每次5min。 （10） 入新配的底物显色(同直接法)。 （11） 清水冲洗。 （12） 苏木素复染细胞核。 （13） 脱水、透明、封片。 【 结 果 】 阳性反应部位呈棕黄色，细胞核淡蓝色。 说明：上述各产生抗体动物均为举例，实际工作中不限于此，但不同抗体应由免疫不同动物产生；第二抗体和第一抗体所用动物之间不应有交叉反应。 免疫荧光技术 直接法 （1） 冰冻切片用PBS洗3次，每次5min，吹干；石蜡切片常规脱蜡至水，PBS冲洗。 （2） 用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗体覆盖切片，放湿盒内37培育3060min或 4过夜。 （3） PBS洗3次，每次5min，吹干。 （4） 缓冲甘油封片。 间接法 （1） 同直接法（1）。 （2） 第一抗体覆盖切片，放湿盒内37培育3060min或4过夜。 （3） PBS洗3次，每次5min。 （4） 异硫氰酸荧光素标记的第二抗体培育切片，湿盒内37 培育3060min。 （5） PBS洗3次，每次5min，吹干。 （6） 缓冲甘油封片。 双标记直接法 （1） 同直接法（1）。 （2） 用异硫氰酸荧光素标记的A抗体,和用异硫氰酸若丹明(呈桔红色荧光)标记的B抗体的混合液(适当比例混合)覆盖切片，放湿盒 中37培育3060min或4过夜。 （3） PBS洗3次，每次5min，吹干。 （4） 缓冲甘油封片。 荧光显微镜使用 （1） 严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作。 （2） 在暗室中进行观察。接